水稻组织培养

水稻种子做组织培养的优点
操作简单，节省时间
水稻外植体小，进行表面消毒后不易染菌，愈伤组织诱导率较高
水稻种子保存容易且存活时间更长，可以随时取材实验
参考文献
［1］盛玉婷. 2008. 植物组织培养技术及应用进展( 安徽农学通报， 14 (9) :45~47 ［2］张志良，翟伟菁. 2003. 植物生理学实验指导( 北京: 高等教育出 版社，326~327
［3］倪晋山，1985. 植物生理学实验手册（薛应龙主编），上海科 学技术出版社，63-64
（绿色幼苗在分化根的培养基中生出的根)
当水稻组培苗长高至 3~5cm时，即可进行炼苗，将三角瓶 口打开放置室温下，一定避免强光直射，炼苗 3 天左右即 可进行移栽( 图 F)
(炼苗及移栽成活的水稻再生植株)
水稻炼苗方法
有组培苗的培养瓶开口，培养基上覆水，约1 cm，置于温室3天左右， 然后移栽到土中 先将组培苗水培半个月，水稻营养液要求pH 5，待苗壮实后，移栽到 土中。
培养基母液配置
大量元素母液配制 : ①母液 A1( 浓缩 10 倍 ) : 称取 KNO3 19g 、 NH4NO3 16.5g、MgSO4· 7H2O 3.7g、KH2PO4 1.7g，分别溶解 后混合并定容至 1000ml，4℃保存备用; ②母液A2（浓缩10倍）：称 取CaCl2· 2H2O 4.4g 定容至1000ml，4℃保存备用。 微量元素母液配制( 母液 B，浓缩 100 倍) 称取 MnSO4· 4H2O 2.23g、 ZnSO4· 7H2O 860mg、H3BO3 620mg、KI 83mg、NaMO4· 2H2O 25mg、CuSO4· 5H2O 2.5mg、CoCl· 6H2O 2.5mg，分别溶解并混 合后定容至1000ml，4℃保存备用。
外植体的表面消毒及接种
选取饱满成熟的水稻种子，手工剥去颖壳，选取干净完整的颖果(在超 净工作台内，先用 75％酒精处理 30s，再用 0.1％升汞处理 10min 或 2％次氯酸钠溶液 15min，然后用无菌水冲洗 5~6次(用灭菌后的无菌 滤纸将种子表面的水分吸干，然后用镊子夹取水稻种子轻轻放到愈伤 组织诱导的培养基表面，每瓶 5 粒左右(每接 5 瓶左右，用75％ 酒精 擦拭手和台面，进行消毒。 不同培养阶段的培养基配方及培养条件：愈伤组织诱导和继代培养基 为 M S + 2 , 4 一 D 2 .0 m g / L ， 培 养 条 件 为 黑 暗 培 养 ， 温 度 控 制 在 26(±1)℃;愈伤组织分化芽培养基为MS +6一BA 2. 0 mg/L + NAA 0. 2mg/L，光照强度为3000lux左右，光照时间为14h,温度控制在26(±1) ℃;生根培养基为1 /2MS + NAA 1. 0 mg/L，光照强度为4000lux左右， 光照时间为14h,温度控制在26(±1)℃。
不同培养阶段所需要的生长调节物质有很大的不同，因此不同阶段的 培养基中要加入的生长调节物质是不一样的，如愈伤组织诱导培养基 （MS+2,4-D2.0mg/L）中2,4-D为每升2.0mg，而2,4-D母液的浓度为 0.5mg/ml，则配制时要从其母液中吸取4mL。培养基配制好后，将其 分装至150mL三角瓶中，每瓶40mL左右。用两层牛皮纸或硫酸纸将 装好培养基的瓶口包裹住，用3个乳胶圈将瓶口封紧即可灭菌。培养 基的灭菌条件为 121 ℃，25min 左右，灭菌时要将无菌操作的所需的 备品灭全，包括剪刀、镊子、刀片、无菌水、报纸或滤纸等。
MS固体培养基的配制及灭菌
取 1000ml烧杯一只，加 500ml 水，然后加琼脂 10g，放至电炉子上 ( 铺有石棉网) 加热，边加热边搅拌至琼脂完全溶解(然后加蔗糖或白 糖) 30g 搅拌至其溶解; 分别称取母液 A1 100ml、母液 A2 100ml、母 液 B 10ml、母液C 10ml、母液D 10ml，到此烧杯中，搅拌均匀后用 0.5mol/L HCL 或 0.5mol/L 的 NaOH将培养基 PH 调至 5-8左右。
（愈伤组织在分化芽的培养基中出现绿点）
约5天后，原来出现绿点的愈伤组织整体颜色加深，并有部分芽已向小 苗过渡( 图 C)
（由绿点所长成的丛生芽）
约10天后，有丛生芽长成的幼苗逐渐增多，已有部分幼苗 叶片展开( 图 D)
（由丛生芽长成的绿色幼苗）
将幼苗的植株移至生根培养基中。3天左右即可生出根，然后逐渐增 多，此时可以明显看见在培养基中的生出的根( 图 E)
实验结果
根据上述培养基配方所建立起来的水稻植株再生体系，愈伤组织诱导 率)芽分化率及生根率均较高。水稻种子在诱导培养中培养10天左右， 从水稻芽的基部长出淡黄色)呈细小颗粒状的愈伤组织( 图 A)
（水稻种子在诱导培养中所得ห้องสมุดไป่ตู้的愈伤组织）
将愈伤组织转入分化芽的培养基后约7天，开始出现绿点并逐渐增多 ( 图 B）
水稻组织培养
实验原理
植物组织培养主要利用了植物细胞的全能性，细胞全能性 (toti potency)就是指每个生活的细胞中都包含有产生一个 完整机体的全套基因，在适宜的条件下，细胞具有形成一 个新的个体的潜在能力。
材料
选取水稻种子( 干种子或是湿种子均可)作为植物组织培养 的外植体
仪器
电子天平、酸度计、微量移液器、电炉、培养瓶、培养皿、烧杯、量 筒、移液管、容量瓶、玻璃棒、试剂瓶、超净工作台、剪刀、镊子、 照度计、摇床、灭菌锅
铁盐母液配制 ( 母液 C 浓缩 100 倍 ) : 称取 Na2-EDTA 3.77g 、 FeSO4•7H2O 2.78g、分别溶解并混合后定容至 1000ml，4℃保存备 用。
有机物质母液配制( 母液 D，浓缩50倍) : 称取甘氨酸 100mg、盐酸硫 胺素20mg、盐酸吡哆素25mg、烟酸E25mg、肌醇 5000mg，分别溶 解后混合并定容至 500ml，4℃保存备用。 生长调节物质母液配制: 为了操作方便，生长调节剂也可先配制成母 液(药品在配制时若不溶于水，可用少量溶剂先溶解，如萘乙酸 （NAA），吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3），2,4-D等生长素和玉 米素（ZT） 可先用少量 95％ 酒精溶解，然后加水，若溶解不完全再 加热; 激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量 1mol/L 的 HCL 中，叶酸需用少量稀氨水溶解称取 50mg 生长调节物质，溶解后，蒸 馏水定容至 100ml，配制的母液每毫升则含有生长调节物质 0.5mg， 4℃保存备用。