半乳糖苷酶活测定

1.5 β—半乳糖苷酶粗酶液的提取

将菌株接种于产酶培养基中，30℃培养60h，过滤收集菌体，充分洗涤，加柠檬酸--磷酸氢二钠缓冲液（0.1mol/L，pH5.0）研磨，破壁菌液离心所得上清液即为粗酶液。

1.6 酶活力的测定

在试管中加入100µl邻硝基苯酚-β-D半乳糖苷（ONPG），800µL 10.2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，100µl酶液，混匀，50℃水浴中反应10分钟，加2ml 1mol/L终止反应，测定计算酶活力。

酶活力单位定义：在上述反应条件下，每分钟分解ONPG，生成1µ mol邻硝基苯酚（ONP）所需的酶量为1个酶活力单位（U）。

1.2.1 酶活力的测定

以ο-NPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。酶活力单位定义为以ο-NPG为底物37℃保温酶解，每分钟释放出1µmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。

β-半乳糖苷酶活测定采用Genstar 的β-半乳糖苷酶检测试剂盒法。在有β-半乳糖苷酶存在的条件下，无色的反应底物会转化生成黄色的硝基酚(o-nitrophenol)。向各管中加入一定量的反应终止液，离心测定420 nm 和550 nm 下的吸光度。

β-半乳糖苷酶活性单位数(U)=1000- (OD420 -1.7 OD550)/Time(min)×V(mL)×

1.5 酶活力测定方法

将pH6.5的磷酸缓冲液500µl和0.25%的ONPG 200µl加入比色管,在25℃的温度下温浴5min,加入适当稀释的粗酶液0.5ml,反应10min,加入800µl 5%Na2CO3终止反应,蒸馏水定容至10ml,用分光光度计420nm测定OD值,通过标准曲线方程计算酶活。

在上述条件下1ml粗酶液1min催化水解ONPG生成1µmol邻硝基苯酚(ONP)的量,定义为1U。

1.2培养基

初筛培养基：乳糖0.5%，硫酸镁0.007%，磷酸氢二钾0.01%，氯化钙0.004%，硫酸铵0.01%，琼脂1.5%，自然pH，每100mL培养基中加入20mg/mL X-gal溶液200µL；

复筛培养基：乳糖1.5%，蛋白胨1.0%，酵母浸膏0.3%，氯化钠0.1%，pH值7.0；

发酵培养基：乳糖3.0%，蛋白胨1.5%，酵母浸膏1.0%，氯化钠0.3%，pH值7.0。