哺乳动物胚胎冷冻保存综述

哺乳动物胚胎冷冻保存综述

09动物生物技术2班 200930380216 宋骥晨

摘要：哺乳动物胚胎冷冻保存效果受冷冻保护剂、冷冻方法、解冻方法等多种因素影响, 其中冷冻方法是一个关键性因素。目前胚胎冷冻方法主要有常规慢速冷冻法和玻璃化冷冻法两种。常规慢速冷冻法是指利用甘油、乙二醇等做冷冻保护剂通过缓慢降温的方式进行胚胎冷冻; 玻璃化冷冻法是指利用高浓度的冷冻保护剂通过快速降温的方式进行胚胎冷冻。与常规慢速冷冻法相比, 玻璃化冷冻法简化了操作过程, 大大缩短了操作时间, 不需昂贵的程序控制冷冻仪。

关键词：胚胎; 冷冻保存; 冷冻保护剂; 冷冻; 解冻

胚胎冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程序使胚胎在

-196℃温度下停止代谢活动, 而升温后又不失去代谢能力的一种长期保存技术, 是实现动物胚胎生产技术实用化和商业化的重要保证。1972年, whittingham等首先发明了慢速冷冻法, 成功地保存了小鼠胚胎, 并在解冻后移植产下了后代。这种方法经过30多年的发展, 冷冻效果已基本稳定, 迄今为止, 已有多种动物胚胎经常规冷冻、解冻后移植至受体得到后代。

1.胚胎冷冻保存原理

胚胎细胞是发育中的细胞, 细胞内水分含量达到80%以上, 如

果不经保护, 冷冻时细胞内部就会形成冰晶, 破坏蛋白质的结构使其发生不可逆的变化, 从而导致胚胎死亡。常规慢速冷冻法的原理是通过加入低浓度的防冻剂, 缓慢降温将胚胎内的水分在冻结前脱出, 阻止冷冻过程中形成有害冰晶而造成胚胎损伤。将胚胎放到含有渗透性防冻剂的溶液中,防冻剂使胚胎细胞内的水分能够在-10℃以上不冻结并且能替换出部分水分。随着降温的进行, 细胞外液开始形成冰晶, 细胞外液浓度变高, 由于渗透压的原理使细胞内的水分开始脱出。为了保证细胞外液冰晶形成的时间总是早于细胞内液, 大多数冷冻程序采用植冰的方式来诱发细胞外液冰晶的生长, 植冰通常在-5℃到- 7℃进行。缓慢降温使细胞内的水分有更多的时间在冻结前脱出。需要指出的是, 胚胎在冷冻过程中不可避免地要形成冰晶。关键是冰晶的大小和数量能否造成胚胎的损伤。玻璃化冷冻保存的原理是在足够低的温度下或采用高浓度的防冻剂使冷冻过程中形成玻璃样物质减少细胞内外冰晶的形成。总之, 无论采取何种冷冻方法, 胚胎冷冻保存的原理都是阻止冷冻、解冻过程中细胞内形成致死冰晶。

2.抗冻保护剂和冷冻保护液

在哺乳动物的胚胎冷冻过程中, 冰晶的形成对胚胎的损伤是致命的。-15℃~ -50℃是一个致死温度区, 在这个温度区细胞容易形成大的冰晶。加入抗冻保护剂能避免冰晶的形成。抗冻保护剂主要分为3类：（1）低分子质量可渗物质, 如甲醇、乙二醇、丙二醇、甘油等一些醇类; （2）低分子质量不可渗物质, 如葡萄

糖、半乳糖、蔗糖等糖类; （3）高分子质量不可渗物质, 如聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉以及其他一些聚合物。冷冻保护液常用杜氏磷酸盐缓冲液来配制, 并且保持ph 值为7.2~7.4也可用简单的生理盐水或TCM-199来配制。这些低温保护剂以不同的方法来保护胚胎细胞免受冷冻损伤, 有效的低温保护剂可将各种低温保护剂有机结合起来。

3.冷冻方法

自从1972年whittingham等首次采用慢速冷冻法成功地冷冻保存小鼠胚胎以来, 许多学者开始了对胚胎冷冻保存方法的研究, 研究的热点主要集中在提高冷冻保存胚胎的活力和简化冷冻程序上。到目前为止, 胚胎冷冻方法主要有常规慢速冷冻法、玻璃化冷冻法。

3.1常规慢速冷冻

尽管哺乳动物胚胎冷冻保存技术已经出现多年, 冷冻技术的研究也取得了很大的进步, 但是到目前为止, 常规慢速冷冻法仍然是哺乳动物胚胎冷冻保存的主要方法。此方法选择较低浓度的渗透性冷冻保护剂, 采用缓慢降温和快速解冻的方法来冷冻保存胚胎。常规慢速冷冻法可分为以下几个步骤（1）室温下胚胎置于冷冻液中5-10min, 使胚胎和冷冻液间达到平衡; （2）在-5℃到-9℃之间植冰; （3）以0.3℃-0.6℃/分的速度缓慢降温;(4)降温到-30℃到-40℃之间, 投入液氮中保存;（5）以250℃/分的速度快速解冻; （6）在培养或移植前, 室温下除去冷冻保

护剂。

3.2玻璃化冷冻

玻璃化冷冻保存是指通过冷冻过程中形成玻璃样物质来减少细胞内外冰晶的形成, 以保护胚胎的一种冷冻方法。这种方法采用快速降温和高浓度的冷冻保护剂, 使冷冻过程中溶液变得十

分黏稠和坚固, 不形成冰晶。自从1985 年Rally 和Fahy 首次用玻璃化法冷冻小鼠胚胎获得成功, 玻璃化冷冻技术就成为学者

们的研究热点。目前,玻璃化冷冻技术不仅能成功地冷冻保存多种哺乳动物的胚胎,而且还能冷冻保存对低温敏感性高的卵母细胞。影响胚胎玻璃化冷冻保存效果的两个关键因素是冷冻保护剂和冷冻速度。只有最大冷冻速度和最低冷冻保护剂浓度之间达到平衡, 才能获得好的冷冻效果。要在一定的冷冻速度下形成玻璃化状态,就需要高浓度的冷冻保护剂, 但是浓度过高的冷冻保护剂又会对胚胎产生毒害。不同种冷冻保护剂形成玻璃化的能力和对胚胎的毒性也不一样。因此寻找毒性低、形成玻璃化能力强的玻璃化冷冻液成为胚胎玻璃化冷冻研究的热点之一。大量研究表明把不同种类的冷冻保护剂组合成玻璃化冷冻液, 能达到降低

冷冻保护剂对胚胎毒害作用, 提高玻璃化冷冻效果的目的。

冷冻速度是形成玻璃化状态的另一个关键因素, 提高冷冻速度可以使玻璃化溶液中冷冻保护剂的浓度降低, 降低冷冻保护

剂对胚胎的毒害作用。起初, 胚胎的冷冻载体采用0. 25mL 或0. 5mL 的细管, 直接投入液氮中。为提高胚胎的冷冻速度, 研究人

员发明了许多非常具有创意的冷冻载体。Vajta G 等( 1998 ) 发明了OPS 法,Lane M 等( 1999 ) 采用冷环法, Liebermann J 等( 2002) 发明FDP 法, Vanderzw almen P 等( 2003) 发明半管法, Son W Y 等( 2003) 采用电镜铜网法( electron microscopy copper grids) , Bagis H 等( 2005) 利用金属表面法( metal surface) , Niasar-i Naslaji( 2006) 采用电泳上样吸头法。这些新型冷冻载体都极大的提高了冷冻速度, 不同程度地提高

了玻璃化冷冻效果。在这些研究中, Vajta 发明的OPS法最受欢迎。OPS 法是通过将细管加热后拉长拉细, 使得管壁变薄, 细管体积变小来提高冷冻速度的, 其冷冻速度达20 000℃/ min 以上。采用OPS法冷冻胚胎防止了冷冻损伤, 降低了冷冻保护剂的毒性和渗透性损伤。目前, 多项研究表明OPS法的冷冻保存结果达到或超过了常规慢速冷冻法。即使对采用常规慢速冷冻法不易成功冷冻保存的细胞或胚胎, 如卵母细胞、猪胚胎、体外受精胚胎、经过显微操作的胚胎等, OPS 法也取得了较好的效果。

4. 解冻方法

解冻方法对胚胎的存活和进一步发育能力有很大的影响, 研究表明慢速解冻能够降低胚胎的存活率。水浴解冻可以使温度变化速度为4460℃/min, 而在空气中解冻才不到196℃/min, 且这种解冻方法经常导致透明带破裂。总之, 快速解冻对提高胚胎冷冻效果是非常有益的。一般解冻时将细管在空气中或10℃到28℃停留10s,然后投入22℃到35℃间的水浴中10s到30s。解冻后为了