盐酸小檗碱对糖尿病大鼠胸主动脉内皮损伤的保护作用

盐酸小檗碱对糖尿病大鼠胸主动脉内皮
损伤的保护作用
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
作者：张卓王春梅王春艳白岩王丽杰徐嘉琪陈立【摘要】目的探讨盐酸小檗碱对2型糖尿病血管内皮功能损伤的保护作用。

方法采用小剂量链脲佐菌素腹腔注射加高脂饲料喂养的方法建立2 型糖尿病大鼠模型。

将模型动物随机分为模型组、盐酸小檗碱组，另设正常对照组以及正常盐酸小檗碱组。

用药组灌胃给药8 w后，做葡萄糖耐量实验；检测各组动物血清中空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、空腹血清胰岛素(FINS)的水平；检测血清中一氧化氮(NO)和超氧化物歧化酶(SOD)含量；免疫组织化学方法检测内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达。

结果与模型组比较，盐酸小檗碱治疗组FPG、TC、TG水平明显下降(P0.05)，血清胰岛素水平有所升高，但无显著性差异（P＞0.05）；盐酸小檗碱能明显提高糖尿病大鼠胰岛素敏感指数，同时提高大鼠对腹腔注射葡萄糖的耐受力，改善胰岛素抵抗(均P0.01)；盐酸小檗碱可显著降低糖尿病组大鼠血清中NO含量，提高SOD水平(P0.05，P0.01)；显
著降低胸主动脉组织eNOS蛋白表达(P0.05)；而正常大鼠给予盐酸小檗碱治疗，上述指标未出现明显改变。

结论盐酸小檗碱对2型糖尿病大鼠血管内皮损伤具有明显的保护作用。

【关键词】盐酸小檗碱；糖尿病；血管内皮；一氧化氮；eNOS 【Abstract】Objective To observe the effect of berberine on serum NO level, SOD activity and eNOS expressions of aorta in type 2 diabetic rats induced by high fat diet plus STZ and explore the mechanism underlying protective effect of berberine on endothelial dysfunction. Methods Wistar rats were randomly divided into diabetic, control, diabetic rats treated with berberine (100 mg/kg), and control rats treated with berberine groups. After treatment, intraperitoneal glucose tolerance test(IPGTT) was performed. The serum fasting blood glucose, insulin, total cholesterol and triglyceride levels were tested, and insulin sensitivity index was calculated. The serum NO level and SOD activity were measured. In addition, eNOS protein expression was measured by immunohistochemical methods. Results Berberine significantly decreased fasting blood glucose, total cholesterol, triglyceride levels in diabetic rats. Berberine treatment also improved IPGTT in diabetic rats and enhanced tissue sensitivity to insulin. After berberine treatment, serum NO level and SOD activity were increased. Immunohistochemical results showed that
berberine increased eNOS expression in diabetic rats aorta.Conclusions Berberine ameliorates diabetic endothelial dysfunction through decreasing blood glucose, lipid, improving insulin resistant, antioxidant effect and enhancing NO bioavailability.
【Key words】Berberine; Diabetes; Vascular endothelium; NO; eNOS
糖尿病并发心血管事件如动脉粥样硬化（AS）、冠心病发生率是同年龄组非糖尿病患者的3～5倍，是糖尿病致死的主要原因之一〔1〕。

内皮细胞功能障碍不仅是AS形成的早期表现，也是糖尿病血管病变的始动因素和主要病理变化。

研究表明，高糖、高脂、胰岛素抵抗(IR)及氧化应激均可导致血管内皮受损，发生功能障碍〔2〕；其治疗策略应该是调整糖脂代谢紊乱，同时改善血管内皮功能损伤。

但目前临床治疗糖尿病及其并发症的主要措施只是降低血糖或直接针对并发症治疗。

盐酸小檗碱（黄连素）是我国传统中药，近年临床及动物试验均证明其具有确切的降血糖、降血脂、改善IR、抗过氧化等作用，对糖尿病具有显著的疗效〔3～5〕。

但盐酸小檗碱是否可以减轻糖尿病引起的血管内皮功能损伤，从而防治糖尿病心血管并发症尚未见报道。

本实验旨在探讨盐酸小檗碱对2型糖尿病(T2DM)血管内皮功能损伤的保护作用。

1 材料与方法
1.1 动物及饲料
选用健康清洁级雄性Wistar大鼠，体重160～180 g，由吉林
大学实验动物中心提供（许可证号：20030001)普通饲料成分及其热量：脂肪5%、碳水化合物53%、蛋白质23%、包括纤维素及水分在内的其他成分占19%，总热量为25 kJ/kg；高脂饲料成分及其热量：脂肪22%、碳水化合物48%、蛋白质20%、包括纤维素及水分在内的其他成分占10%，总热量为44.3 kJ/kg。

1.2 药物及试剂
盐酸小檗碱由东北制药厂赠予；链脲佐菌素（STZ）为Sigma 公司产品；葡萄糖、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）检测试剂盒均为北京北化康泰临床试剂有限公司产品；胰岛素放射免疫分析药盒购自天津九鼎生物技术有限公司；一氧化氮(NO)和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购于南京建成生物技术有限公司；内皮型一氧化氮合酶(eNOS)多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司；免疫组化试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器
酶标仪Model 550，为Bio Rad公司产品。

755B 型紫外可见分光光度计，系上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂产品；台式高速低温离心机，美国索福公司产品；1261型γ放射免疫计数仪，LKB 公司产品。

1.4 T2DM动物模型的建立及分组〔4〕
60只Wistar雄性大鼠，随机分出正常对照组（CON）和正常盐酸小檗碱组（CON+BER）各10只，以普通饲料喂养；其余40只用于建立T2DM大鼠模型，以高脂饲料喂养。

大鼠高脂饲料喂养4
w后，腹腔注射小剂量STZ（30 mg/kg）2次，间隔1 w；2 w后检测空腹血糖(FPG)，以FPG≥7.8 mmol/L作为判断模型成功的标准。

将制备成功的T2DM大鼠26只随机分为糖尿病模型组（T2DM）和盐酸小檗碱治疗组（T2DM+BER）。

T2DM+BER组和CON+BER组以盐酸小檗碱100 mg·kg-1·d-1连续灌胃8 w，CON组和T2DM组给予等体积溶媒灌胃8 w。

1.5 血清中FPG、TG、TC和空腹血清胰岛素(FINS)的检测
大鼠治疗8 w后，禁食12～16 h，乌拉坦（100 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主动脉取血并处死动物。

每只大鼠约可以取血4～5 ml，分离血清，分装入Eppendorf 管，-70℃冻存，用于检测FPG、TG、TC和FINS。

FPG、TG和TC采用酶学方法检测。

FINS由吉林大学第三医院核医学科采用放免法检测。

1.6 葡萄糖耐量实验
葡萄糖耐量实验进行前，大鼠禁食12～16 h，自由饮水，腹腔注40%葡萄糖（2 g/kg体重），在葡萄糖注射前、注射后30、60、120 min断尾取血，3 500 r/min离心15 min，吸取血清。

随后按照试剂盒说明书，利用葡萄糖氧化法测定血清中葡萄糖含量。

1.7 血清中NO和SOD的检测
分别按照NO和SOD试剂盒说明书方法测定血清中NO及SOD的含量。

1.8 免疫组化方法检测大鼠胸主动脉组织eNOS蛋白表达
切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗。

抗原热修复，已
修复切片恢复室温；PBS洗3次，每次3 min；滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min。

滴加一抗(1∶150)，4℃过夜；PBS洗3次，滴加生物素化二抗，室温20 min；PBS洗3次，滴加HRP链霉卵白素，室温20 min；DAB显色。

苏木精复染2 min、盐酸乙醇分化；脱水、透明、中性树胶封片。

阴性对照用PBS代替一抗。

于显微镜400倍下观察细胞质出现棕色或棕黄色颗粒者为阳性,不显色者为阴性。

1.9 统计学方法
实验数据用x±s表示，统计分析采用SPSS 13.0 软件处理，多组间比较用单因素方差分析(One Way ANOVA)方法，两组间比较采用最小显著差异(LSD)t检验。

2 结果
2.1 盐酸小檗碱对大鼠体重和生化指标的影响
T2DM组大鼠精神萎靡、毛发稀落欠光泽，糖尿病症状较重，与其他3组相比，体重略有升高，但无统计学差异(P0.05)。

T2DM+BER组大鼠经灌胃治疗8 w后，精神状态良好，毛发较润泽，糖尿病症状明显减轻。

与CON组比较，T2DM组FPG、TG 和TC 水平明显增高(P0.05)，血清胰岛素水平略有降低，胰岛素敏感指数(ISI)明显下降(P0.05)。

盐酸小檗碱治疗8 w显著降低了糖尿病大鼠血清FPG、TG 和TC水平(P0.05)，提高了ISI(P0.05)，而对正常大鼠血糖及血脂没有影响。

见表1。

表1 各组大鼠体重及生化指标变化(略)
2.2 盐酸小檗碱对大鼠腹腔注射葡萄糖耐量的影响
如图1所示，CON组、CON+BER组及T2DM+BER组在葡萄糖注射后30 min血糖达峰值，在90 min内逐渐下降；而T2DM组血糖在60 min达峰值，后缓慢下降，T2DM组血糖水平与CON组相比一直维持在较高水平。

结果表明T2DM大鼠对葡萄糖耐受力下降，出现IR，而盐酸小檗碱可明显提高机体对葡萄糖的耐受量，改善了IR。

2.3 盐酸小檗碱对血清NO含量和SOD活性的影响
与CON组比较，T2DM组血清NO含量及SOD活性明显降低(P＜0.01)，盐酸小檗碱治疗8 w后明显增加糖尿病大鼠血清NO水平和SOD活性(P＜0.05)，而对正常大鼠NO水平及SOD活性无明显影响。

见表2。

2.4 盐酸小檗碱对大鼠胸主动脉组织eNOS蛋白表达的影响
如图2B和图2C所示，CON组和CON+BER组大鼠胸主动脉内膜区（主要是内皮细胞胞质）可见连续线状棕黄色阳性染色，即eNOS阳性表达；而T2DM组血管内膜区棕黄色着色明显减弱，局部出现未表达区（图2D）。

盐酸小檗碱治疗组与T2DM组比较，eNOS表达明显增加（图2E）。

表2 盐酸小檗碱对各组大鼠血清NO、SOD水平的影响(略)
3 讨论
血管内皮损伤是糖尿病血管并发症的主要发病机制之一。

高血糖、高血脂、高胰岛素血症均会使氧化应激增加，氧自由基产生增多，造成血管内皮细胞损伤〔2〕。

因此，要想维持T2DM患者血管内皮的
正常功能，同时改善患者的糖、脂、胰岛素代谢是十分重要的。

本实验显示，盐酸小檗碱可显著降低高脂饮食联合小剂量STZ诱导的T2DM大鼠FPG、TG、TC水平，并提高ISI，改善IR，有效遏制了导致内皮细胞损伤的始动环节。

NO是内皮来源的最重要的血管舒张因子，主要调节较大的输送血管张力〔5〕。

NO除了具有强烈的血管舒张功能外，还具有抗血小板聚集、抗平滑肌细胞增殖和抑制单核巨噬细胞向血管迁移等作用。

因此，NO生物活性下降可导致内皮依赖性血管舒张功能损害和促进动脉粥样硬化的形成。

NO被认为是动脉粥样硬化的一个最重要保护因子，是机体对抗动脉粥样硬化的第一道防线〔6〕。

糖尿病时NO减少可能是合成减少和灭活增加造成的。

内皮细胞NO的来源主要通过存在于胞内的eNOS催化L精氨酸脱胍基而产生NO。

研究表明，糖尿病时高血糖、IR状态、脂代谢异常、炎性细胞因子分泌上调等多种因素均可引起eNOS活性下降或表达降低，从而使NO合成和分泌减少，造成糖尿病内皮依赖性血管舒张功能障碍而出现心血管并发症〔7〕。

本实验结果表明盐酸小檗碱有很好的保护血管内皮细胞的作用。

氧化应激是糖尿病导致内皮损伤的主要原因之一。

糖毒性，脂毒性等引起的氧化应激使超氧阴离子等活性氧产生增多。

超氧阴离子可迅速与NO发生反应，将其氧化生成过氧化亚硝基，而导致NO灭活。

过氧化亚硝基也可以将eNOS的辅酶BH4氧化为BH2，降低BH4与BH2比例，从而使eNOS脱耦联，失去催化生成NO的能力，反
而催化超氧阴离子的产生，造成恶性循环〔8〕。

SOD是体内清除自由基的主要酶系之一，可将超氧阴离子迅速氧化为O2和H2O2，有效清除体内的氧自由基，减轻组织损伤。

糖尿病高血糖可与SOD活性中心的赖氨酸结合，产生糖基化反应，使SOD活性下降，清除自由基能力下降〔9〕。

本实验结果显示，糖尿病大鼠血清SOD活性明显下降，盐酸小檗碱治疗显著提高了血清SOD水平，增强其抗氧化能力，减少NO的破坏，从而增加了NO的生物活性，保护内皮依赖性血管舒张功能。

综上所述，盐酸小檗碱治疗显著改善了T2DM大鼠的糖、脂代谢和IR，提高了大鼠胸主动脉eNOS蛋白表达和血清SOD活性，增加了NO合成，减少NO破坏，保护糖尿病引起的内皮功能损伤。

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