Red同源重组技术研究进展

Red 同源重组技术研究进展

韩 聪

1,2

张惟材

1*

游 松

2

(1军事医学科学院生物工程研究所 北京 100071 2沈阳药科大学 沈阳 110016)

摘要 伴随着分子生物学的发展,一种基于 噬菌体Red 重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究。Red 重组系统由三种蛋白组成:E xo 蛋白是一种核酸外切酶,结合在双链

DNA 的末端,从5 端向3 端降解DNA,产生3 突出端;Beta 蛋白结合在单链DNA 上,介导互补单链DNA 退火;Gam 蛋白可与RecBC D 酶结合,抑制其降解外源DNA 的活性。Red 同源重组技术具有同源序列短(40~60bp)、重组效率高的特点。这种技术可在DNA 靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA 。Red 同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行,大大推动功能基因组研究的发展。关键词 Red 同源重组 基因打靶 基因工程收稿日期:2003 08 05 修回日期:2003 11 03*通讯作者,电子信箱zhangweicai@

同源重组是基因工程实验中常用的技术手段,在基因打靶和基因克隆方面具有重要作用。常规的基因打靶技术是以Rec A 同源重组为基础,通常需要数百碱基甚至更长的同源序列,并且重组效率较低,更由于真核基因组中大量重复序列的存在,而导致意外重排现象的发生。B AC 、PAC 、YAC 等克隆载体的构建为基因克隆提供了有力工具,但常规的克隆操作依赖于限制性酶切位点的存在,还需繁琐的连接、纯化步骤,大大限制了对大片段基因功能的研究。近几年来,一种基于 噬菌体Red 重组酶作用的同源重组技术逐渐成为基因工程研究的热点之一,并取得了一系列重要进展。

Red 同源重组技术的原理是将一段携带与靶基因两翼各有40~60bp 同源序列的PCR 片段导入宿主菌细胞,利用 噬菌体Red 重组酶的作用,使导入细胞的线性DNA 片段与染色体(或载体)的特定靶序列进行同源重组,靶基因被标记基因置换下来(如图1所示)。PC R 引物由两部分组成,靠近5 端的区域为与靶基因同源的序列(约40bp),靠近3 端的区域(约20bp)与模板DNA 互补。这种重组技术是最近发展起来的一项可在染色体水平上进行遗传操作的新技术,只需较短的同源序列,

而不需要特定的限制性酶切位点,即可在生物体内完成重组过程,省去了体外DNA 酶切、连接等步骤。这样,在靶基因两翼序列已知的条件下就可以

通过Red 重组技术对该基因进行敲除、敲入、点突变等操作,还可在靶基因的上下游加入适当的启动子和终止子序列以调节基因的表达。将含有ori 复制序列的线性载体片段导入细胞,也可将靶基因克隆于载体上。实验证明,这种基因打靶技术是基因功能研究和新菌株构建的有力工具。

1 Red 同源重组机制

Red 同源重组系统由 噬菌体exo 、bet 、gam 三个基因组成,它们分别编码Exo 、Beta 、Gam 三种蛋白质。E xo 蛋白是一种核酸外切酶,单亚基的分子量为24kD,这种蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子,中间有一中空的通道,通道的一端可容纳

双链DNA 分子,另一端只可容纳单链DNA [1,2]

。Exo 蛋白可结合在双链DNA 的末端,从DNA 双链的5 端向3 端降解DNA,产生3 突出端。Beta 蛋白是一种退火蛋白,单亚基的分子量为25 8kD 。在溶液中,Beta 蛋白自发地形成环状结构,紧紧地结合在单链DNA3 突出端,防止DNA 被单链核酸酶

降解,同时介导互补单链DNA 的退火[3]

,双链DNA 退火完成后,Beta 蛋白从DNA 双链上解离下来。Beta 蛋白在Red 同源重组过程中起着决定性的作

第23卷第12期

中 国 生 物 工 程 杂 志CHINA BIOTEC HNOLOGY 2003年12月本页已使用福昕阅读器进行编辑。

福昕软件（Ｃ）２００５－２００９，版权所有，

仅供试用。

图1 Red 同源重组技术用于基因打靶

Ha 和Hb:同源重组区域;Pa 和Pb:引物位点;sm:筛选标记

用,它与沙门氏菌P22噬菌体的Erf 蛋白、大肠杆菌Rac 噬菌体的Rec T 蛋白、真核生物的Rad52蛋白同属一类重组蛋白家族,都具有介导互补单链DNA 退火的功能

[4]

。Ga m 蛋白为16kD 的多肽分子,可

与RecB CD 核酸外切酶结合,抑制其对外源DNA 的降解作用[5]

。当Beta 蛋白与单链DNA3 突出端结合形成丝状体后,重组机制分为两种:若参与重组的另一同源序列为没有断裂的双螺旋DNA 链,单链DNA 在Rec A 蛋白的作用下侵入双链DNA,完成重组过程,这一机制称为链侵入(strand invasion)模型;若另一同源序列为单链DNA,Beta 蛋白介导互补单链DNA 退火,完成重组过程,这一机制称为单链退火(single strand annealing)模型[6]

,如图2所示。

由于Rac 噬菌体的RecE 、Rec T 蛋白分别具有Exo 、Beta 蛋白的活性,也可介导重组作用的完成,因此,Red 重组又称为E T 重组[7]

。Muyrers 等

[8]

对

ET 重组机制进行研究,发现只有当RecE Rec T 、Exo Beta 蛋白配对使用时,重组才能进行。尽管RecE 、Rec T 蛋白分别与Exo 、Beta 蛋白的功能类似,但当它们交叉配对使用时,重组功能无法实现。此外,Zhang 等[9]

发现当RecT 蛋白过量表达时,重组效率明显提高。与大肠杆菌Rec A 重组机制不同的是,Red 同源重组不存在对Rec A 蛋白的绝对依赖性,

避免了RecA 蛋白引起的基因重排和随机重组,并

图2 Red 重组机制示意图

且重组效率远高于RecA 重组。

2 Red 同源重组技术应用策略

Red 重组技术利用较短的同源序列,即可使外源DNA 片段与靶标分子完成重组作用,但通常在靶标分子上留下筛选标记基因,染色体或载体上含有筛选标记,有可能影响其生物功能。Red 重组技术与其它基因工程技术结合运用,有效地解决了以上问题。目前利用Red 重组技术进行基因工程研究的策略主要有以下4种[7]

(如图3所示):(1)一步筛选,中间为筛选标记基因两端为同源序列的线性DNA 片段借助同源序列与靶载体发生重组作用,标记基因将靶基因置换下来。线性DNA 若为含有ori 复制起点序列的载体片段,可通过重组作用,将靶基因克隆于载体上。(2)筛选+反向筛选,在第一轮重组中,线性DNA 片段含有筛选标记和反向筛选标记两个基因,通过筛选标记基因将重组分子筛选出来。在第二轮重组中,线性DNA 片段中的目的基因将重组分子上的两个筛选标记基因置换,通过反向筛选标记基因将第二轮重组分子筛选出来,常用的反向筛选标记基因有sac B 、tet R 、rps L 等。(3)筛选+位点特异性重组,筛选标记基因的两侧含有被Cre 或FLP 位点特异性重组酶识别的特殊位点,经过第一次筛选的重组分子可通过位点特异性重组酶的作用将筛选标记基因删除,但在重组分子上留下34(或36)bp 的特殊序列。(4)筛选+限制性酶切反应,在筛选标记基因的两侧存在限制性酶切位点,利用限制性内切酶切割重组分子后,再将其连接。这种技术不仅可将标记基因删除,而且在重组分子上创造出惟一的酶切位点。Red 同源

18

中 国 生 物 工 程 杂 志第23卷