第2章 菌种的来源、生物活性物质的筛选和菌种保藏

透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据， 因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之 间并不完全成正比。
但作为初筛的手段是有意义的
2）、变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底 物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落 周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；
如
筛选果胶酶产生菌
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
第二节 菌种的分离
★ 菌种的分离方法概括为两大类：
一、施加选择性压力分离法 因为不同种类微生物 其生长繁殖时对环境和营养的要求不同，如温度、 PH、渗透压、氧气、碳源和氮源等。培养时，人 为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生 长，而不利于其它微生物的生存，以达到使目的 菌种占优势，而得以快速分离纯化的目的。 二、随机分离法 有些利用微生物生产的目的产物 对菌种的筛选没有直接的指示作用，因此常采用 随机分离法进行分离。如：抗生素、抗肿瘤药物、 酶抑制剂、抗病毒药物、生长因子产生菌、免疫 激活剂、多糖等生产菌。
调查研究（包括资料查阅） 试验方案设计 采样 增殖条件探索 第一次增殖培养
筛 选 工 作 程 序
第一次原种斜面
第一次平板分离
第二次增殖培养 根据实际情况进 行定量或半定量 测定
第二次平板分离
第二次原种斜面
定量或半定量测定
初筛（1株1瓶）
第三次平板分离
第三次原种斜面 复筛 不纯 第四次平板分离 第四次原种斜面 第三次菌种保藏
4）、生态学参数及培养基 的组成原则
A、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境 生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶 剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。
B、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须 含有10-50%的天然提取物。加入培养基中的天 然提取物，部分培养基中则应含有多种碳、氮源， 如几丁质、纤维素或果胶。
一、微生物是生物活性物质的丰富资源
微生物资源丰富，广布于土壤、水和空气等自然界中， 种类之多至今仍是一个难以估计的未知数。它们除了能 生活在动、植物可以生长的环境中外，还可以生活在动、 植物不能生长的环境中，为适应环境对它们生存造成的 压力，它们进化出许多特殊的生理活性物质。所以微生 物过去、现在以及将来都是人类获得生物活性物质的丰 富资金源。 1、微生物工业上常用菌种：细菌、放线菌、真菌（酵母 菌、霉菌）
4)、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或 一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。 富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来 富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以 纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集 所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。 5)、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减少 到一定程度。在分离培养基中加入一定的抗生素 即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。
2）、用于分离放线菌的预处理技术
• 干热处理：土壤在120℃或100 ℃干热处理能够 极大地减少分离平板上的丝状细菌和链霉菌。 • 杀菌剂苯酚（1.5%）、葡萄糖酸洗必泰 （CG0.01%)和苄索氯铵（BC 0.01%):不同的 放线菌孢子对杀菌剂的抗性不同。链霉菌的孢 子和杆菌及假单孢菌的营养细胞用苯酚、CG 和BC有30 ℃处理30min即被杀死；相反的，小 双孢菌属的孢子对各种杀菌剂都有相当强的抗 性。
酵母菌 种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵母、面包酵母 应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱 蜡和制取蛋白质、生产脂肪
面包酵母
啤酒酵 母
红酵 母
wenku.baidu.com菌
曲霉属
应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡 萄糖氧化酶
应用：酱油、酱类（淀粉酶）
米曲霉 应用：产糖化酶和蛋白酶、 主要用于酿酒制曲和酱油 制曲
2、利用固体平板的生化反应进行分离 （方法之一）
利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初 步分离的方法。
分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性 或利用某些代谢产物生化反应来设计的。 可显著提高分离效率
透明圈法
变色圈法
生长圈法
抑菌圈法
1）、透明圈法 在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培 养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉 酶、脂肪酶、核酸酶等；
高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开； 需注意，所需菌型生长的结果有时会改变培养基的 控制pH可分离嗜酸或嗜碱微生物； 性质，从而改变选择压力。 高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物； 重复移植几次后接种少量已富集的培养物到固体培 养基上。 移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势的情况 下进行。 自生固氮菌的分离
初步工艺条件摸索
再复筛
1株3-5瓶 较优菌株
种子培养
保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株
某些必要试验和毒性试验
二、含微生物样品的采集
较复杂；应根据分离目的灵活掌握 土壤（丰富、 5-25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）
食品 、海水、动物、植物、极端环境
根据微生物的营养类型采样
2）．植物体采集方法
• 在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、 安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一 小块，并注意不要损伤周围边缘。 • 选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在 一片叶上的取样部位。 • 采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法 相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时， 一般与根际土样一起保存。
应用：生产甲义丁二酸
毛
霉
应用：可以产生蛋白酶，我国 多用于豆腐乳、豆豉等的制作
根霉
种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉 应用：酿酒
青霉菌
C
应用：生产青霉素、葡萄糖氧 化酶
2、菌种分离与筛选工作程序
菌株分离（isolation)就是将一个混杂着各 种微生物的样品通过分离技术区分开，并 按照实际要求和菌株的特性，采取迅速、 准确、有效的方法对它们进行分离、筛选， 进而得到所需微生物的过程。
森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素， 肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶 适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。 产生菌。 根据微生物的生理特性采样 面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌 筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样； 筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样
常用的细菌

大肠杆菌 应用：对谷氨酸定量分析， 生产天冬氨酸、苏氨酸、缬 氨酸。
乳酸杆菌 应用：乳酸、干酪、奶子 酒、发面、泡菜、酸奶等 的制作
枯草芽孢杆菌 应用：生产淀粉酶
放线菌
种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰 色链霉菌、红霉素链霉菌 应用：各类抗生素。土霉素、四环素、 链霉素、红霉素
3）、抑制剂的选择
• 在放线菌分离琼脂中通常都加入重铬酸钾或放 线菌酮，以抑制真菌、细菌的繁殖。
4）、放线菌分离方法研究的发展趋势
• 一是：深入研究稀有放线菌的生态分布、生理 特性及其他特殊性质，以设计出适合不同类群 菌株的分离方法。 • 二是：向特殊的生态环境发展，如海洋等极端 环境，从中分离极端类群以获得新的物种资源。
• 放线菌大量存在于土壤中。许多放线菌既可以产 生抗生素(目前发现的几千种抗生素中，有一半以 上是由放线菌产生的）和具有生物活性的次生代 谢物质，又可以用于生物处理废物过程。 1）、分离源的选择 • 可选择土壤：耕地、水田、河湖岸边、平地森林、 山地森林、山地草原和牧场 • 植物材料：根、叶、落叶、堆肥、干草。 • 河、湖、海的水及其底泥。
• 植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液
适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂布平 板。
3）．水样采集方法
• 用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的 广口塑料瓶中。 • 由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静 水层中采集水样。 • 方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶 口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的 话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出 时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。 所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下 贮存。 水中细菌的分离：水样通过0.22μm无菌滤膜，取出滤 膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀 释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。
C、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线 菌酮和制霉素)，掺加浓度一般为50~100μg／m1， 以抑制真菌的生长。 D、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育 l~2天。
E、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应 调节到与试样的生态系统参数值相近。
5、真菌分离
1)、利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落 分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利 用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制 扩散性真菌的生长。 2)、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分 离。 3)、有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分 离培养时应加以考虑。
4、自然界中细菌的分离
1）．土样采集方法
• 森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层 顺序采集； • 水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆 筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5～ 15cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻 璃瓶中。 • 在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢 慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗 去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根 部残留的土，这部分上却为根际土样。 •土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m1涂布 已添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等) 的土浸出汁平板。
用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微 生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果 红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会 出现绛红色水解圈。
又如 分离解脂微生物 豆油作底物 甘油三丁酸酯为底物
中性红（红～黄. 6.8～8.0. ）指示
菌落周围呈红色圈
罗丹明B为指示剂
荧光圈
3）、生长圈法
第二章
生产菌种来源、生物活性物 质的筛选和菌种保藏
发酵工业生产水平 的三个决定要素:
生产菌种的性能
发酵和提取工艺条件
生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工业生产的第一环 节.
第一节
菌种来源
• 根据资料直接向有科研单位、高等院校、 工厂或菌种保藏部门索取或购买；
• 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
4）、抑菌圈法
常用于抗生素产生菌的分离筛选 据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的抗生素产生 菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十分重要。 抑菌圈法是常用的初筛方法 工具菌采用抗生素的敏感菌
若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等， 便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈
3、放线菌的分离
一、施加选择性压力分离法 1、富集(enrichment)培养 是在目的微生物含量较少时，根据微生物的 生理特点，设计一种选择性培养基，创造有 利的生长条件，使目的微生物在最适的环境 下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然 条件下的劣势种变成人工环境下的优势种， 以利分离到所需的菌株。
其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其 他菌型生长的条件，例如，供给特殊的基质或加入某些 抑制剂。 控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开；
发酵工业上使用的微生物菌种，最初都是从自然界中 分离筛选出来的。 分离与筛选菌种的具体做法一般分4个步骤： 样品采集 增殖培养 纯种分离
生产性能测定
★
培养分离中要解决的问题
（1）“分离什么和从哪里分离出?” （2）必须充分考虑所分离微生物的生产能力、 生长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其 提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定性 及遗传操作的难易程度等。 （3）选择适宜的培养分离方法和检测方法。
通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和 维生素的产生菌 工具菌（指示菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株 将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进 行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌 落周围便会形成一个混浊的生长圈
如 嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混 合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围 出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌