高活性纤维素酶菌株的筛选及鉴定

院学报, 2007, 12( 2) : 11- 04.
[2] 石磊,赵由才, 柴晓利. 我国农作物秸秆的综合利用技术进展[ J] . 中国沼气,
2005, 23( 2) : 11- 14.
[3] 刘丽香,吴承祯, 洪伟, 等. 农作物秸秆综合利用的进展[ J] . 亚热带农业研究,
2005, 2( 1) : 75- 80.
天津 内蒙古 黑龙江 安徽 山东 湖南 海南 新疆 云南 青海
302 1698 3824 2924 7191 2074 176 1463 1486 205
从表 3 我们可以看出河北,福建,河南,四川,吉林,湖北,黑龙江,山东秸秆年产量
较多,西藏,上海,宁夏,海南,青海,天津秸秆量比较少.
3、利用情况：近几年我国粮食主产区出现了较为严重的焚烧秸秆污染.每到夏秋
[4]张发群 康氏木霉(T i h d m K i g 一 i 菌株的鉴定及其培养条件对纤维素酶形 成的影响 工业微生物 1 9 8 3 1:6 一 1 2 [5]曹建峰. 秸秆综合利用技术分析[ J] .能源研究与信息,2006, 22( 1) : 22- 25. [6]文少白李勤奋,侯宪文,李光义,邓 晓.微生物降解纤维素的研究概况 中国农学通报 2010,26(01):231-236 [7]焦贵枝, 马照民. 农作物秸秆综合利用[ J] . 中国资源综合利用, 2003, ( 1) : 1921. [8] 王宜民, 范家友, 高红武等. 秸秆综合利用探析[ J] .昆明冶金高等专科学校 学报, 2001, 17( 4) : 15- 18. [9]李洁,何兵,许鹏 ,雷 波.1 株产纤维素酶菌株的筛选及酶学性质的研究[J] 贵 州农业科学,2013,41( 12) ：123～126 （二）、微生物降解纤维素的研究现状
10ml 25ml
数量
1个 1个 1个 1个 1包 2根 1个 2个 2个 1个 1个 2根 10 个 5根 5根 1包 1个 1个 1个 1台 1个 1台 1个
2、培养基（药品种类、数量）： 斜面培养基: 羧甲基纤维素钠培养基 CMC- Na 20g,Na2HPO42. 5g,KH2PO4 1. 5g, 蛋白胨 2. 5g,酵母膏 0. 5g,水 1000mL,琼脂 20g,pH7. 0～7. 2. 富集培养基:富集培养基 K2HPO4 2 g ,( NH4)2S041.4 g,MgSO4•7H20 0.3 g,CaCI 20.3 g,FeSO4·7 H20 5 mg, MnSO4 1 .6 m g , ZnSO4 1 .7 m g , CoC12 2 m g ,新华 1 号滤 纸 2g , p H 5 ,5 , 1 2 1 灭菌 3 0 m i n 初筛培养基：羧甲基纤维素钠培养基 CMC- Na 20g,Na2HPO42. 5g,KH2PO4 1. 5g, 蛋白胨 2. 5g,酵母膏 0. 5g,水 1000mL,琼脂 20g,pH7. 0～7. 2. 复筛 培养基： 液体发酵 培养基 蛋白 胨 10.0 g, 酵母 提取 10.0 g,(NH4)2S04 2.0 g,KH2PO44.0g,CaCl2•2H20 0.3 g,MgS04•7H20 0.3 g,CMC—Na10.0g,H2O1L,pH 值 7.2. 产酶培养基：液体产酶鉴定培养基 羧甲基纤维素钠 ( CMC - Na) 15 g ,NH4N03 l g , MgSO4•7H20 0.05g,KH2PO4l g , H2O1000 mL , p H 自然, 121。C 灭菌 3 0 mi n. （二）、方法
为畜牧饲料;造肥还田;农村生活能源.各种用途所占比例如表 5 所示.牲畜饲料和
农村生活用能仍是秸秆利用的最主要方面, 分别占到秸秆总产出量的 31%和
45%.
表 5 中国秸秆能源利用情况
用途
所占比例/%
造纸比例
2.9
牲畜饲料
30. 9
其中：处理后
14.8
未处理
16.1
农村生活能源
45
秸秆还田及其它损失
过对综合利用农作物秸秆资源,对于纤维素的利用主要是通过化学或生物处理从
பைடு நூலகம்
而实现资源化.微生物分解纤维素是纤维素生物处理技术的核心,对于节约资源、
保护环境、增加农民收入、促进农业的可持续发展都具有重要的现实意义.
5、标注参考文献：
[1] 曹稳根, 高贵珍, 方雪梅等 我国农作物秸秆资源及其利用现状[ J] . 宿州学
3. 00
21. 2
玉米
6. 2
30. 0
0. 77
3. 50
14. 8
豆科干草
6. 1
28. 5
2. 00
9. 31
28. 3
从表 2 中我们可以看出水稻、小麦、玉米、豆科干草这几种农作物秸秆的有机物 成分含有灰分,纤维素,脂肪,蛋白质,木质素，其中水稻成分含纤维素较多，小麦, 玉米,豆科干草含纤维素,木质素较多 2、数量
2、现在研究较多的微生物：研究比较高的类群主要有木霉属,曲霉属, 根霉属, 其 中以木霉最多,黑曲霉次之.如绿色木霉,康氏木霉,黑曲霉等. 3、国内外研究现状：纤维素是由葡萄糖以 1, 4 糖苷键连接而成的线状大分子物 质,是植物组织的基本成分,也是绿色植物光合作用的主要产物.在自然界中有大 量微生物,它们能分泌各种纤维素酶,.纤维素酶是指能够降解纤维素生成葡萄糖 的一组酶的总称,是降解植物纤维素酶的关键酶.纤维素是地球上最廉价、最丰富 的可再生天然资源.目前其资源利用率较低,且不完全利用对环境造成了一定程度 的污染.纤维素可通过纤维素酶转化得到酒精等能源物,不仅可实现农业剩余资源 的高效利用,提高农民收入,而且可作为新资源、新能源造福人类.同时对缓解化石 能源引发的环境污染问题及社会可持续发展均具有重大意义,现已受到世界各国 的普遍重视.高效纤维素酶的研究开发是可再生性资源利用的关键,对解决工农业 原料、能源、环境等问题十分重要.迄今为止,已有很多关于纤维素酶生产菌株的 研究报道,我国对纤维素酶的研究虽有几十年的历史,但由于纤维素酶活性不高, 用量过大,致使生产成本过高而应用受限.因此选育出高活性的纤维素酶就显得尤 为重要. 4、处于何种水平（实验室、中试、生产阶段）：由于此研究规模很小,易于操作, 对于设备要求等不是很严格,大部分都能在实验室就能完成,所以处于实验室水 平. 5、标注参考文献 （三）、本研究主要的内容：通过对绵阳市绵阳师范学院墨家校区种植菜籽的的
1.样品的富集：富集培养过程,向各样品瓶中注 50ml 无菌水,玻璃珠充分振荡,灭菌 纱布过滤,静置,取上清液 1 mL 接种于 250ml 装有增殖培养基 50 mL 的三角瓶中. 摇床 210r／min、2 8 ℃培养 72h,之后再将培养液转入无菌的新鲜增殖培养基中, 反复培养 3 次,使菌富集. 2、初筛方法：配制羧甲基纤维素钠培养基,灭菌,倒好平板,取富集培养液 1ml 再 将其稀释分别为 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7 的浓度,然后分别涂布到相应的平板 上,放置于 28℃培养箱培养 3d.每个平板倒人 20mL 刚果红溶液 (1mg／mL) 染色 2h 后, 加入适量 1mol／L 氯化纳溶液洗涤,能分解纤维素的菌株会出现清晰的透 明圈,测量菌体和透明圈直径,选择出透明圈直径与菌落直径比值大的菌株作为下 一步研究的对象. 2、复筛方法：选取透明圈、菌落直径比值较大菌落及滤纸生长的菌株进行产酶 发酵试验,将菌体接种于 CMC—Na 产酶鉴定培养基,280C、170 r／m i n 摇床培养 5d 后测定羧甲基纤维素钠酶( CMCase) 活力,筛选出酶活较高的菌株作为复筛优 良菌种.
1、降解纤维素的微生物种类: 文献报道的能降解纤维素的细菌有很多,主要有纤维粘菌
(Cytophaga)和纤维杆菌(Cellulomonas)两类.具有降解纤维素能力的放线菌主要有纤维放线菌
(Acidothermus.Cellulolyticus)、诺卡氏菌属 Ncardia)和链霉菌属 （Streptomyces）.真菌由于
我国是农业大国, 秸秆资源十分丰富,分布广,种类多且产量巨大.我国不同地 区农作物秸秆年产量如表 3 所示[5].据联合国环境规划署报道,世界上种植的农作 物每年可提供各类秸秆约 20 亿 t ,我国农作物秸秆年产量为 7 亿 t 左右,列世界之 首,折合标准煤量 3. 53 亿 t , 占全世界秸秆总量的 30%左右.
表 1 几种农作物秸秆的元素成分( %)
种类 N
P
K
Ca
Mg
Mn
Si
水稻 小麦 大豆
0. 60 0. 50 1. 93
0. 09 0. 03 0. 03
1. 00 0. 73 1. 55
0. 14 0. 14 0. 84
0. 12 0. 02 0. 07
0. 02 0. 003 —
7. 99 3. 95
初步鉴定。
意义：纤维素是地球上最廉价、最丰富的可再生天然资源.目前其资源利用率 较低,且不完全利用对环境造成了一定程度的污染.纤维素可通过纤维素酶转化得 到酒精等能源物质,不仅可实现农业剩余资源的高效利用,提高农民收入,而且可 作为新资源、新能源造福人类.同时对缓解化石能源引发的环境污染问题及社会 可持续发展均具有重大意义,本实验采用特殊的初筛方法、复筛方法并经过反复 筛选最终得到的菌株具有产酶活力高的优点,为后续的生理生化鉴定、条件优化 以及更近一步的分子鉴定提供很好的原材料。
收获之际, 浓烟滚滚,这种处理方式不仅浪费了宝贵的自然资源,造成了环境污染,
也造成了事故多发,对高速公路、 铁路的交通安全及民航航班的起降安全等构成
了极大威胁, 并对人类健康和安全造成了严重危害,已成为一大社会问题.目前,农
作物秸秆资源化利用主要可分为 4 个方面: 作为工业原料,主要用于工业造纸;作
土壤进行处理（即富集）,然后经过初筛、复筛.为了获得产酶活力高的菌株,再对 第一次经过初筛、复筛选出的菌株重复几次初筛、复筛操作,最终筛选的菌株的 活力出来的菌株进行鉴定,同时在鉴定过程中对其做其它酶活性的检测,最终将其 进行保藏. (四)、本研究的目的和意义：
目的:纤维素酶是指能够降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称,是降解植物 纤维素酶的关键酶, 酶的研究开发是可再生性资源利用 的关键,对解决工农业原 料、能源、环境等问题十分重要,本实验主要采用较为特殊的初筛培养基以及复 筛方法，通过反复多次的筛选，最终选出产脂肪酶活性较高的微生物菌株并进行
表 3 我国不同地区农作物秸秆年产量( 万 t)
地 区 年产量
地区
年产量
地区
年产量
北京 河北 辽宁 江苏 福建 河南 广东 陕西 四川 西藏
429 4413 550 3549 6643 5650 1405 1334 4464 50
上海 山西 吉林 浙江 江西 湖北 广西 甘肃 贵州 宁夏
179 1338 3371 1134 1304 3202 1525 754 1123 268
具有较高的胞外酶活性且其酶种类比较全面使其有很强的纤维素降解能力,因此对其的研究
报 道 比 较 多 . 己 报 道 的 对 纤 维 素 作 用 较 强 的 菌 株 多 是 木 霉 属 Trichoderma ) 、 曲 霉 属
(Aspergillus)、青霉属 Penicillium)、 枝顶孢霉属(Acremonium)、 漆斑霉属 Myrothecium)、 脉孢霉属 (Neurospora)、毛壳霉属 Chaetomium) 的菌株等.[6]
高活性纤维素酶菌株的筛选及鉴定
前言
（一）、农作物秸秆利用现状 1、成分：农作物秸秆是籽实收获后剩留下的含纤维成分很高的作物残留物,包括 禾谷类、豆类、薯类、油料类、麻类、以及棉花、甘蔗、烟草、瓜果等多种作物 的秸秆,是农作物的主要副产品是自然界中数量极大且具有多种用途的可再生生 物质资源,农作物秸秆含有多种可被利用的有用成分, 除了绝大部分碳之外,还含 有氮、磷、钾、钙、镁、 硅等矿质元素( 见表 1) ,有机成分有纤维素、半纤维 素、木质素、蛋白质、脂肪、灰分等( 见表 2)[7,8]
—
从表 1 中我们可以看出水稻、小麦、大豆都含有 N,P,K,Ca,Mg,Mn,Si，其中大豆 含 N,P 较多,小麦含 Si 较多,水稻含 K 较多。
表 2 几种农作物秸秆的有机成分( %)
种类
灰分
纤维素
脂肪
蛋白质
木质素
水稻
17. 8
35. 0
3. 82
3. 28
7. 95
小麦
4. 3
34. 0
0. 67
21.2
总计
100
4、综合利用的意义:农作物秸秆是一种宝贵的可再生资源, 但是长期以来由于受
消费观念和生活方式的影响, 我国农村秸秆资源完全处于高消耗、高污染、低产
出的状况, 相当多的一部分农作物秸秆被弃置或者进行焚烧, 没有得到合理开发
利用.既造成了秸秆资源的严重浪费,既污染了空气,还会引起火灾及交通问题.通
材料和方法
（一）、材料 1、实验仪器设备（包括详细的低值易耗品种类、数量）：
仪器名称 烧杯
称量纸 玻璃棒 电子天平 三角瓶
钥匙
移液管 培养皿 试管
滤纸 涂布器 接种环 接种针 恒温摇床箱 高压灭菌锅 分光光度计 酒精灯
规格 100ml 250ml 500ml 1000ml
250ml 500ml 大 小 3ml