土壤中难培养微生物培养方法初探
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Abstract B y adding op timum catalase and sodium pyruvate into the diluted culture m edium and using the soil leachate to culture directly, the VBNC m icrobes screened from soil were cultured1 The results showed that som e VBNC m icrobes recovered the fissiparous ability and formed colony1This study was the foundation for utilizing the VBNC m icrobe resources in soil1
LB培养基 菌落数 /24h 菌落数 /48h 菌落数 /96h 菌落数 /总计
1%
42
70
40
152
100%
Baidu Nhomakorabea28
52
20
100
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
本试验结果表明 ,加入 01125%的丙酮酸钠 或 2 000 U /皿过氧化氢酶可提高微生物的可培养 性 , 1%LB 培养基有利于处于 VBNC状态的土壤 微生物的实验室培养 。在土壤浸出液试验中 ,模 拟土壤的环境 ,维持微生物种群间的相互关系 ,结 果膜上虽没有形成菌落但滤膜被分解 ,说明有微 生物的存在 ,但还没有产生足够的菌来形成单菌 落。
摘 要 :通过在培养基中加入适量的过氧化氢酶 、丙酮酸钠和适当的稀释培养基 ,以及采用土壤浸出液直 接培养的方法 ,将从土壤中筛选出的处于不可培养 (VBNC)状态的微生物进行培养 ,结果部分难培养微生物 恢复分裂能力形成菌落 ,这为进一步开发土壤中微生物资源奠定了基础 。
关键词 :土壤微生物 ;难培养 ;培养方法 中图分类号 : S15413 文献标识号 : A 文章编号 : 1001 - 4942 (2009) 01 - 0089 - 03
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
90
山 东 农 业 科 学 2009年
112 方法 称取 20 g土壤样品 ,加到盛有 100 m l无菌水
Key words Soil m icrobe; VBNC; Culture method
微生物的物种资源极其丰富 ,微生物多样性 的研究是整个生物多样性研究的一部分 , Amann 等 (1995) [ 1 ]认为环境微生物中 99%以上是尚未 能被培养的 。Colwell实验室在 1982年提出活的 但不可培养微生物的概念 ( viable but noncultur2 able, VBNC) [ 2 ] 。研究表明 ,微生物这种不可培 养状态是普遍存在的 [ 3, 4 ] 。近几年来对于 VBNC 状态微生物的研究有了较大的进展 ,研究人员通 过不同的方法成功培养了多种 VBNC状态的微生 物 [ 5～7 ] 。
①丙酮酸钠试验 : 取 10 - 4 、10 - 5 、10 - 6稀释度 的菌液各 100 μl,加到含有 01125%丙酮酸钠的 TSA 平板上涂布 , 置 37℃培养 , 分别于培养 24、 36、48 h时计菌落数 。
②过氧化氢酶试验 :将稀释到合适浓度的菌 液 100μl以及已除菌的过氧化氢酶 100 μl分别 加到 TSA 培养基上涂匀 ,置 37℃培养 ,分别于培 养 24、36、48 h时计菌落数 。 11213 土壤浸出液试验 用 40目的筛子处理土 样 ,并于 121℃灭菌干燥 30 m in,加到已灭菌的培 养皿中 , 20～30 g /皿 ,用 LB 液体培养基润湿 。将 已灭菌的 0122 μm 微孔滤膜放置于湿润土壤上 , 每个平板放 5片 。取适当稀释度的菌液 50 μl加 到滤膜上 ,置于 37℃培养 。每 24 h补充 1 m l LB 液体培养基和 1 m l土壤浸出液 (土壤浸出液 : 50 g土壤加入 100 m l双蒸水中 , 140 r/m in 振荡 20 m in,静置 ,取上清液 ) ,于培养 24、36、48、60 h时 观察计菌落数 。 11214 低浓度试验 取适合浓度的菌液 100 μl 分别加到 1% LB 培养基和 100% LB 培养基中涂 匀 , 37℃培养 ,记录培养 24、48、96 h时的菌落数 , 长出的菌落重新挑到相应的平板上培养观察 。
1 材料与方法
111 材料 11111 试验材料 取距离地表 5～10 cm 的棕壤 土 ,迅速置于塑料袋中密封 ,于 4℃冰箱中保存 。 11112 试剂 胰蛋白胨 、酵母提取物 、氯化钠 、大 豆蛋白胨 、磷酸二氢钾 、琼脂 、丙酮酸钠 、过氧化氢 酶 ,以上药品均为国产分析纯 。 11113 仪器 DNP - 9162 型电 热恒 温培 养箱 (上海精宏试验设备有限公司 ) ; YJ - 1450超净工 作台 (上海博讯实业有限公司医疗设备厂 ) ;电子 天平 JA I003 (上海恒平仪器有限公司 ) 。 11114 培养基 培养基为 LB、TSA。
收稿日期 : 2008 - 09 - 26 基金项目 :山东省优秀中青年科研奖励基金项目 (2006BS06012)资助 。 作者简介 :李正华 (1986 - ) ,男 ,在读硕士 ,研究方向 :环境微生物学 ; E - mail: zhenghua0407@1631com 3 通讯作者 :丁延芹 ,副教授 ,硕士研究生导师 ; E - mail: dingyq6885@1631com
2 结果与分析
211 培养基浓度试验结果 由图 1 可知 ,在 50% LB 固体培养基上菌落
最少 ,而且随着培养基浓度的降低或升高平板上 菌落数有升高的趋势 。当培养基营养成分浓度较 高时 (50% ～100% ) ,平板上生成菌落所需时间 一般为 36～48 h,多为可培养微生物 ;而当培养基 营养成分浓度较低时 ( 25% ～50% ) ,平板上生成 菌落所需时间在 60 h以上 ,多为难培养微生物 。
表 1 添加物试验结果
培养基 TSA +丙酮酸钠 TSA +过氧化氢酶
菌落数 /24h 菌落数 /36h 菌落数 /48h
54
79
115
48
72
109
TSA
43
65
99
213 土壤浸出液试验结果 经过 36 h培养 ,在滤膜上没有看到明显的菌
落 ,但滤膜已经被部分分解 ,这说明微生物已经繁 殖 ,但还没有产生足够的菌来形成单菌落 。本试 验模拟了土壤的环境 ,维持微生物种群间的相互 关系 ,提供了有利于微生物生长的条件 。 214 低浓度试验结果
综上所述 ,低浓度培养基可减少自身产生有 害物质 ;模拟自然环境 ,维持微生物种群间的相互 关系是提高环境中微生物可培养性的关键 。因 此 ,提高微生物可培养方法的研究应该在培养过 程中结合多种培养因素 、组合采取多种培养方案 来取代模拟一种培养条件的方案 ,可以获得更多 可培养的微生物及更高效的培养结果 [ 12～14 ] 。
参 考 文 献 :
[ 1 ] Amann R I, Ludwig W , Schleifer K H1 Phylogenetic identifi2 cation and in situ detection of individual m icrobial cells without cultivation [ J ] 1 M icrobiol1Rev1, 1995, 59 ( 1) : 143 - 1691
在 37℃培养 96 h, 1% LB 平板上共长出 152 个菌落 , 100%LB 平板上长出 100个菌落 (表 2) 。 培养 48 h以内产生的菌落较少 ,培养 48 h时后有 大量菌落出现 。对从低浓度培养基中筛选出的 1 52株菌进行验证 ,没有得到处于 VBNC状态的
表 2 低浓度试验结果
山 东 农 业 科 学 2009, 1: 89～91
Shandong Agricultural Sciences
土壤中难培养微生物培养方法初探
李正华 1 ,张冬梅 2 ,张晓峰 1 ,杜秉海 1 ,丁延芹 13
(11山东农业大学生命科学学院 ,山东 泰安 271018 21泰安市农业局 ,山东 泰安 271000)
的三角瓶中 (含玻璃珠 ) , 140 r/m in 振荡 20 m in, 静置 ,取 1 m l上清液系列稀释至 10 - 9。 11211 培 养 基 浓 度 试 验 配 制 浓 度 为 25%、 50%、100%的 LB 培养 基 。取 合 适 浓 度 的 菌 液 100μl加到 LB 平板中涂布 , 37℃培养 ,分别于培 养 36、48、60、96 h时观察计菌落数 ,注意保持湿 润 。96 h后长出的菌落重新挑到相应的平板上 培养观察 。 11212 添加物试验 [ 9, 10 ]
第 1期 李正华等 :土壤中难培养微生物培养方法初探
91
微生物 。主要原因可能是所设计的低浓度培养条 件不能够使处于 VBNC状态的微生物很好地适应 新环境而死亡 。
3 讨论与结论
本研 究 从 土 壤 寡 营 养 基 质 使 微 生 物 处 于 VBNC状态的角度出发 ,初步摸索出一套研究土 壤中难培养微生物的方法 。为进一步研究土壤微 生物多样性和微生物的 VBNC状态提供了方法上 的依据 ,对实现土壤中处于 VBNC状态微生物的 实验室培养具有一定的意义 。
培养基浓度较低时 ,微生物可以缓慢摄入适量营 养物质避免由于产生过多自由基和超氧化物导致 细胞死亡 。 [ 11 ]
图 1 培养基浓度对菌落的影响
212 添加物试验结果 从表 1可以看出 ,丙酮酸钠 ( 01125% ) 、过氧
化氢酶 ( 2 000 U /皿 )的添加能够使菌落数增加 。 对从加有丙酮酸钠固体培养基中筛选出的 251株 菌和加有过氧化氢酶固体培养基中筛选出的 203 株菌进行验证 ,它们都能在没有添加物的 TSA 板 上生长 ,只是过氧化氢酶固体培养基上筛选出的 两株菌生长极其缓慢 ,菌落很小 。说明原来难培 养的微生物由于适应了含添加物的培养基 ,生成 了完整的细胞结构 。
In itia l Study on Culture M ethod for V iable But
Nonculturable So il M icrobes
L I Zheng - hua1 , ZHAN G Dong - m ei2 , ZHANG X iao - feng1 , DU B ing - hai1 , D IN G Yan - qin13 ( 11College of L ife S cience, S handong A g ricu ltu ra l U n iversity, Ta ian 271018, Ch ina; 21Ta ian A g ricu ltu ra l B u reau, Ta ian 271000, Ch ina)
土壤中的微生物大多处于“寡营养 ”状态 ,当 被接种到营养丰富的培养基上时 ,由于过量营养 物质的摄入 ,基质迅速氧化导致过多的自由基和 超氧化物产生 ,损害了细胞甚至导致细胞死亡 ,从 而在培养基上不产生菌落 [ 8 ] 。本研究通过低浓 度培养基试验和添加物试验筛选土壤中处于
VBNC状态的微生物 ;采用土壤滤膜培养法 ,模拟 土壤环境 ,维持微生物的原有状态 ,初步探索了土 壤中处于 VBNC状态微生物的培养方法 。
LB培养基 菌落数 /24h 菌落数 /48h 菌落数 /96h 菌落数 /总计
1%
42
70
40
152
100%
Baidu Nhomakorabea28
52
20
100
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
本试验结果表明 ,加入 01125%的丙酮酸钠 或 2 000 U /皿过氧化氢酶可提高微生物的可培养 性 , 1%LB 培养基有利于处于 VBNC状态的土壤 微生物的实验室培养 。在土壤浸出液试验中 ,模 拟土壤的环境 ,维持微生物种群间的相互关系 ,结 果膜上虽没有形成菌落但滤膜被分解 ,说明有微 生物的存在 ,但还没有产生足够的菌来形成单菌 落。
摘 要 :通过在培养基中加入适量的过氧化氢酶 、丙酮酸钠和适当的稀释培养基 ,以及采用土壤浸出液直 接培养的方法 ,将从土壤中筛选出的处于不可培养 (VBNC)状态的微生物进行培养 ,结果部分难培养微生物 恢复分裂能力形成菌落 ,这为进一步开发土壤中微生物资源奠定了基础 。
关键词 :土壤微生物 ;难培养 ;培养方法 中图分类号 : S15413 文献标识号 : A 文章编号 : 1001 - 4942 (2009) 01 - 0089 - 03
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
90
山 东 农 业 科 学 2009年
112 方法 称取 20 g土壤样品 ,加到盛有 100 m l无菌水
Key words Soil m icrobe; VBNC; Culture method
微生物的物种资源极其丰富 ,微生物多样性 的研究是整个生物多样性研究的一部分 , Amann 等 (1995) [ 1 ]认为环境微生物中 99%以上是尚未 能被培养的 。Colwell实验室在 1982年提出活的 但不可培养微生物的概念 ( viable but noncultur2 able, VBNC) [ 2 ] 。研究表明 ,微生物这种不可培 养状态是普遍存在的 [ 3, 4 ] 。近几年来对于 VBNC 状态微生物的研究有了较大的进展 ,研究人员通 过不同的方法成功培养了多种 VBNC状态的微生 物 [ 5～7 ] 。
①丙酮酸钠试验 : 取 10 - 4 、10 - 5 、10 - 6稀释度 的菌液各 100 μl,加到含有 01125%丙酮酸钠的 TSA 平板上涂布 , 置 37℃培养 , 分别于培养 24、 36、48 h时计菌落数 。
②过氧化氢酶试验 :将稀释到合适浓度的菌 液 100μl以及已除菌的过氧化氢酶 100 μl分别 加到 TSA 培养基上涂匀 ,置 37℃培养 ,分别于培 养 24、36、48 h时计菌落数 。 11213 土壤浸出液试验 用 40目的筛子处理土 样 ,并于 121℃灭菌干燥 30 m in,加到已灭菌的培 养皿中 , 20～30 g /皿 ,用 LB 液体培养基润湿 。将 已灭菌的 0122 μm 微孔滤膜放置于湿润土壤上 , 每个平板放 5片 。取适当稀释度的菌液 50 μl加 到滤膜上 ,置于 37℃培养 。每 24 h补充 1 m l LB 液体培养基和 1 m l土壤浸出液 (土壤浸出液 : 50 g土壤加入 100 m l双蒸水中 , 140 r/m in 振荡 20 m in,静置 ,取上清液 ) ,于培养 24、36、48、60 h时 观察计菌落数 。 11214 低浓度试验 取适合浓度的菌液 100 μl 分别加到 1% LB 培养基和 100% LB 培养基中涂 匀 , 37℃培养 ,记录培养 24、48、96 h时的菌落数 , 长出的菌落重新挑到相应的平板上培养观察 。
1 材料与方法
111 材料 11111 试验材料 取距离地表 5～10 cm 的棕壤 土 ,迅速置于塑料袋中密封 ,于 4℃冰箱中保存 。 11112 试剂 胰蛋白胨 、酵母提取物 、氯化钠 、大 豆蛋白胨 、磷酸二氢钾 、琼脂 、丙酮酸钠 、过氧化氢 酶 ,以上药品均为国产分析纯 。 11113 仪器 DNP - 9162 型电 热恒 温培 养箱 (上海精宏试验设备有限公司 ) ; YJ - 1450超净工 作台 (上海博讯实业有限公司医疗设备厂 ) ;电子 天平 JA I003 (上海恒平仪器有限公司 ) 。 11114 培养基 培养基为 LB、TSA。
收稿日期 : 2008 - 09 - 26 基金项目 :山东省优秀中青年科研奖励基金项目 (2006BS06012)资助 。 作者简介 :李正华 (1986 - ) ,男 ,在读硕士 ,研究方向 :环境微生物学 ; E - mail: zhenghua0407@1631com 3 通讯作者 :丁延芹 ,副教授 ,硕士研究生导师 ; E - mail: dingyq6885@1631com
2 结果与分析
211 培养基浓度试验结果 由图 1 可知 ,在 50% LB 固体培养基上菌落
最少 ,而且随着培养基浓度的降低或升高平板上 菌落数有升高的趋势 。当培养基营养成分浓度较 高时 (50% ～100% ) ,平板上生成菌落所需时间 一般为 36～48 h,多为可培养微生物 ;而当培养基 营养成分浓度较低时 ( 25% ～50% ) ,平板上生成 菌落所需时间在 60 h以上 ,多为难培养微生物 。
表 1 添加物试验结果
培养基 TSA +丙酮酸钠 TSA +过氧化氢酶
菌落数 /24h 菌落数 /36h 菌落数 /48h
54
79
115
48
72
109
TSA
43
65
99
213 土壤浸出液试验结果 经过 36 h培养 ,在滤膜上没有看到明显的菌
落 ,但滤膜已经被部分分解 ,这说明微生物已经繁 殖 ,但还没有产生足够的菌来形成单菌落 。本试 验模拟了土壤的环境 ,维持微生物种群间的相互 关系 ,提供了有利于微生物生长的条件 。 214 低浓度试验结果
综上所述 ,低浓度培养基可减少自身产生有 害物质 ;模拟自然环境 ,维持微生物种群间的相互 关系是提高环境中微生物可培养性的关键 。因 此 ,提高微生物可培养方法的研究应该在培养过 程中结合多种培养因素 、组合采取多种培养方案 来取代模拟一种培养条件的方案 ,可以获得更多 可培养的微生物及更高效的培养结果 [ 12～14 ] 。
参 考 文 献 :
[ 1 ] Amann R I, Ludwig W , Schleifer K H1 Phylogenetic identifi2 cation and in situ detection of individual m icrobial cells without cultivation [ J ] 1 M icrobiol1Rev1, 1995, 59 ( 1) : 143 - 1691
在 37℃培养 96 h, 1% LB 平板上共长出 152 个菌落 , 100%LB 平板上长出 100个菌落 (表 2) 。 培养 48 h以内产生的菌落较少 ,培养 48 h时后有 大量菌落出现 。对从低浓度培养基中筛选出的 1 52株菌进行验证 ,没有得到处于 VBNC状态的
表 2 低浓度试验结果
山 东 农 业 科 学 2009, 1: 89～91
Shandong Agricultural Sciences
土壤中难培养微生物培养方法初探
李正华 1 ,张冬梅 2 ,张晓峰 1 ,杜秉海 1 ,丁延芹 13
(11山东农业大学生命科学学院 ,山东 泰安 271018 21泰安市农业局 ,山东 泰安 271000)
的三角瓶中 (含玻璃珠 ) , 140 r/m in 振荡 20 m in, 静置 ,取 1 m l上清液系列稀释至 10 - 9。 11211 培 养 基 浓 度 试 验 配 制 浓 度 为 25%、 50%、100%的 LB 培养 基 。取 合 适 浓 度 的 菌 液 100μl加到 LB 平板中涂布 , 37℃培养 ,分别于培 养 36、48、60、96 h时观察计菌落数 ,注意保持湿 润 。96 h后长出的菌落重新挑到相应的平板上 培养观察 。 11212 添加物试验 [ 9, 10 ]
第 1期 李正华等 :土壤中难培养微生物培养方法初探
91
微生物 。主要原因可能是所设计的低浓度培养条 件不能够使处于 VBNC状态的微生物很好地适应 新环境而死亡 。
3 讨论与结论
本研 究 从 土 壤 寡 营 养 基 质 使 微 生 物 处 于 VBNC状态的角度出发 ,初步摸索出一套研究土 壤中难培养微生物的方法 。为进一步研究土壤微 生物多样性和微生物的 VBNC状态提供了方法上 的依据 ,对实现土壤中处于 VBNC状态微生物的 实验室培养具有一定的意义 。
培养基浓度较低时 ,微生物可以缓慢摄入适量营 养物质避免由于产生过多自由基和超氧化物导致 细胞死亡 。 [ 11 ]
图 1 培养基浓度对菌落的影响
212 添加物试验结果 从表 1可以看出 ,丙酮酸钠 ( 01125% ) 、过氧
化氢酶 ( 2 000 U /皿 )的添加能够使菌落数增加 。 对从加有丙酮酸钠固体培养基中筛选出的 251株 菌和加有过氧化氢酶固体培养基中筛选出的 203 株菌进行验证 ,它们都能在没有添加物的 TSA 板 上生长 ,只是过氧化氢酶固体培养基上筛选出的 两株菌生长极其缓慢 ,菌落很小 。说明原来难培 养的微生物由于适应了含添加物的培养基 ,生成 了完整的细胞结构 。
In itia l Study on Culture M ethod for V iable But
Nonculturable So il M icrobes
L I Zheng - hua1 , ZHAN G Dong - m ei2 , ZHANG X iao - feng1 , DU B ing - hai1 , D IN G Yan - qin13 ( 11College of L ife S cience, S handong A g ricu ltu ra l U n iversity, Ta ian 271018, Ch ina; 21Ta ian A g ricu ltu ra l B u reau, Ta ian 271000, Ch ina)
土壤中的微生物大多处于“寡营养 ”状态 ,当 被接种到营养丰富的培养基上时 ,由于过量营养 物质的摄入 ,基质迅速氧化导致过多的自由基和 超氧化物产生 ,损害了细胞甚至导致细胞死亡 ,从 而在培养基上不产生菌落 [ 8 ] 。本研究通过低浓 度培养基试验和添加物试验筛选土壤中处于
VBNC状态的微生物 ;采用土壤滤膜培养法 ,模拟 土壤环境 ,维持微生物的原有状态 ,初步探索了土 壤中处于 VBNC状态微生物的培养方法 。