猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒_PRRSV_检测方法的建立

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文章编号:1000-1573(2009)01-0082-04

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV )

检测方法的建立

苏晓鸥1, 李玉荣2, 乔俊文1, 赵德明1

(1.中国农业大学动物医学院国家动物海绵状脑病实验室,北京100193;

2.河北农业大学动物科技学院,河北保定071000)

摘要:根据G eneBank 中已经发表的PRRSV 毒株的ORF6基因高度保守序列,设计并合成了一对特异性引物,建立了用于检测PRRSV 的RT -PCR 诊断方法。从感染PRRSV -QD 的Marc -145细胞中提取病毒RNA ,然

后经RT -PCR 扩增,获得预期266bp 的目的片断,而猪伪狂犬病毒(PRV )、猪细小病毒(PPV )、猪圆环病毒

(PCV )细胞培养物及Marc -145细胞进行同条件检测,结果为阴性;PRRSV 扩增产物测序结果与G eneBank 中

已发表的PRRSV 毒株序列同源性达9414%~9714%且应用本研究检测方法对已知基因型的10株PRRSV 盲检,检出率100%。上述研究结果表明,所建立的RT -PCR 诊断方法特异性好、敏感性高,可进一步应用于猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断。

关 键 词:猪繁殖与呼吸综合征;PRRSV ;ORF6;RT -PCR ;检测中图分类号:S 852.65

文献标识码:A

The establishment of detecting method for porcine reproductive

and respiratory syndrome virus(PRRSV )

SU X iao 2ou 1,LI Y u 2rong 2,QI AO J un 2wen 1,ZH AO De 2ming 1

(1.National Animal Transmissible S pongiform Encephalopathy Laboratory ,College of Veterinary Medicine ,China Agricultural University ,Beijing 100193,China ;

2.College of Animal Science and Technology ,Agricultural University of Hebei ,Baoding 071000,China )

Abstract :Based on highly conservative ORF6gene sequence of PRRSV on G eneBank ,a pair of primers was designed and synthesized.The R T -PCR method for detecting PRRSV was estab 2lished.PRRSV -QD RNA was extracted from virus -infected Marc -145cell and then am plified by R T -PCR.The positive 266bp specific fragment was obtained as expected.Under the same con 2ditions ,however ,the results for detection of PRV ,PPV ,PCV and Marc -145cell by R T -PCR were all negative.The amplified sequence of PCR product of PRRSV -QD shares 9414%-9714%homology with the published sequence of other PRRSV strains from G eneBank.The results indicate that R T -PCR method in this research has high sensitivity and specificity ,and could be further ap 2plied for PRRSV clinical diagnosis.

K ey w ords :porcine reproductive and respiratory syndrome virus ;PRRSV ;ORF6;R T -PCR ;de 2tecting

收稿日期:2008-07-03

基金项目:科技部:兽医微生物菌种资源标准化-朊病毒类资源标准化整理整合及共享(2005K DA21205-7);实验用小

型猪地方标准研究;北京市科委(D07080200720701)

作者简介:苏晓鸥(1982-),女,辽宁沈阳人,在读硕士生,主要从事分子病理学科研工作.E 2mail :xiaoousu @ 通讯作者:赵德明(1958-),男,教授,博士生导师,主要从事分子病理学科研工作.E 2mail :zhaodm @

第32卷第1期2009年1月

河北农业大学学报

JOURNAL OF AGRICUL TURAL UNIVERSITY OF HEBEI

Vol.32No.1Jan .2009

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是20世纪80年代末出现在美国和欧洲的一种猪的新病毒性疾病,其主要症状表现为妊娠母猪早产、流产、产死胎和木乃伊胎以及仔猪出现呼吸困难为主要特征的传染病[1]。目前,PRRS几乎遍布了所有养猪国家,对我国乃至世界养猪业造成严重经济损失。

PRRS的病原为PRRSV,是一种有囊膜的正链单股RNA病毒,属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属,基因组长约15kb含8个开放阅读框(ORFs)[2]。ORF5~7编码病毒的主要结构蛋白,其中ORF6编码病毒的基质蛋白(M)。PRRSV的基因型有两种,欧洲型和美洲型[3]。在这两种基因型之间,ORF6这段基因片段具有高度保守性[4]。所以,鉴于PRRSV这一特点,本研究根据G eneBank中的已经发布的PRRSV ORF6序列的高度保守区设计了一对引物,建立并优化了PRRSV的R T-PCR检测方法,以期用于临床PRRSV的快速诊断,同时也将有助于PRRSV流行病学的调查研究。

1 材料与方法

1.1 毒株与细胞

PRRSV-QD(为青岛所分离本试验室鉴定保存)、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒均为本实验室分离和保存毒株;Marc-145细胞为中国农业大学传染病与微生物组郭鑫老师馈赠。

1.2 主要试剂

Trizol试剂、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、DEPC、dN TP mix、DNA Marker均购于北京通宝达生物科技发展有限公司,胶回收试剂盒购于北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。

1.3 引物设计与合成

根据G eneBank中已经发表的VR-2332毒株的ORF6(14629~14895位核苷酸)基因序列,通过引物设计软件Oligo610设计了一对引物,可用于扩增出266bp的基因片断。引物送由上海生物工程有限公司合成。

上游P1:5’-TTTGGGG A GTGTACTCGGC2 CA TA G A-3’

下游P2:5’-GGCA TA TTTG ACAA GGTTT2 ACCACT-3’

1.4 RNA的提取

取PRRSV-QD、PRV、PPV、PCV及Marc-145的细胞培养液各200μL于4个不同的115mL 的离心管中,每个离心管中加入800μL Trizol试剂,摇匀后室温静置5min,加200μL氯仿剧烈震

荡15s混匀,室温静置10min,12000r/min4℃离心15min,RNA存在于上层水相中。小心吸取上清转入另一新的DEPC水处理过的115mL离心管中,加入等体积的冰异丙醇,室温静置10min, 12000r/min离心10min,弃上清同上,加入1mL 的75%乙醇洗涤沉淀,轻轻摇匀。7500r/min离心5min,吸弃上清液,室温干燥5~10min。用20μL 无RNase水溶解沉淀,-80℃保存。

1.5 RT-PCR

1.5.1 反转录(Reverse transcription) 在115mL 离心管中分别加入5μL总RNA,1μL的随机引物,混匀。70℃加热5min后立即冰浴,按顺序加入以下试剂:6μL5×R T-缓冲液,1μL RNase抑制剂, 2μL D TT,2μL dN TP,1μL AMV反转录酶;215μL dN TP,1315μL DEPC水,42℃孵育1h;72℃作用10min,取出-20℃保存备用。

1.5.2 聚合酶链式反应(PCR) PCR反应总体积为20μL,其中灭菌双蒸水6μL,10×buffer2μL, dN TP mix10μL,上游引物(P1)015μL,下游引物(P2)0.5μL,cDNA模板3μL,按下列程序进行PCR反应:94℃5min;95℃30s,64℃30s,72℃45 s,30个循环;72℃延伸10min。PCR产物用10g/L 琼脂糖凝胶电泳。

1.6 测序及序列分析

序列测定由北京三博远志生物技术有限责任公司完成后,应用DANMAN软件将所测得的核酸序列与G eneBank中所发表PRRSV基因序列HQ-5 (EU177111),GCH-3(EU177121),LV (AF184212),VR2332(U87392),ORF6对应区域进行序列比较分析。

1.7 方法应用

用本研究中已经建立的R T-PCR检测方法对本验室室保存的已知基因型的10株不同的PRRSV 毒株(其中3株为欧洲型,另7株为美洲型)进行盲检。将得出结果与已知情况相对比。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR扩增结果及特异性

应用上述引物和反应体系,对PRRSV-QD、PRV、PPV、PCV细胞培养物及Marc-145细胞进行R T-PCR扩增,结果仅PRRSV-QD扩增出266bp的特异性片段(图1),与预期结果相符。其他病毒无任何扩片段。从而证实了本研究建立的IBDV R T-PCR检测方法的有效性和特异性。

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 第1期 苏晓鸥等:猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)检测方法的建立

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