差异显示技术及其应用

1．原理 ． 差异基因表达是细胞分化的基础。 差异基因表达是细胞分化的基础。正是这些基因在 细胞中的特异表达与否，决定了生命历程中细胞的 细胞中的特异表达与否， 发育和分化、细胞周期的调节、细胞衰老和死亡等。 发育和分化、细胞周期的调节、细胞衰老和死亡等。 mRNA DD-PCR技术正是对组织特异性表达基因进 技术正是对组织特异性表达基因进 行分离的一种快速而行之有效的方法。 行分离的一种快速而行之有效的方法。不同的组织 /细胞或遗传背景相同的同一组织 细胞经过不同的 细胞或遗传背景相同的同一组织/细胞经过不同的 细胞或遗传背景相同的同一组织 处理后，提取各自的总RNA，进行mRNA的逆转录 处理后，提取各自的总RNA，进行mRNA的逆转录 合成 cDNA。进行逆转录时3'端引物采用 。进行逆转录时 端引物采用 oligo(dT)l2MN，其中 为A、C、G中的任何一种， 中的任何一种， ，其中M为 、 、 中的任何一种 N为A、C、G或T中的任何一种，所以共有 种 中的任何一种， 为 、 、 或 中的任何一种 所以共有12种 oligo(dT)l2MN引物。其申 称为锚定引物，起增 引物。 称为锚定引物， 引物 其申M称为锚定引物 大引物Tm值的作用。N称为分类碱基，对逆转录 值的作用。 称为分类碱基 称为分类碱基， 大引物 值的作用 进行归类。 进行归类。
TCR基因只能在 细胞中表达，而不能在B细胞中表达。 基因只能在T细胞中表达，而不能在 细胞中表达。 基因只能在 细胞中表达 细胞中表达 细胞mRNA制备来的单链 制备来的单链cDNA，同大大超量的 细 从T细胞 细胞 制备来的单链 ，同大大超量的B细 胞的mRNA在有利于发生 在有利于发生DNA-RNA杂交的条件下保温， 杂交的条件下保温， 胞的 在有利于发生 杂交的条件下保温 所有的能够在T和 两类细胞中同时表达的 两类细胞中同时表达的T细胞基因的 所有的能够在 和B两类细胞中同时表达的 细胞基因的 cDNA分子（约占 分子（ ），都能与 细胞的mRNA退火 分子 约占98%），都能与 细胞的 ），都能与B细胞的 退火 形成DNA-RNA杂交分子，而不能在 细胞中表达的、T 杂交分子， 细胞中表达的、 形成 杂交分子 而不能在B细胞中表达的 细胞特有的cDNA（约占 ），由于 细胞中没有相应 ），由于 细胞特有的 （约占2%），由于B细胞中没有相应 的mRNA，仍然处于单链的状态。将此种杂交混合物通 ，仍然处于单链的状态。 过羟基磷灰石柱（ ），于是 过羟基磷灰石柱（hydroxylapatite column），于是 ）， DNA-RNA杂交杂分便结合在柱上，而游离的单链 杂交杂分便结合在柱上， 杂交杂分便结合在柱上 cDNA则过柱流出。如此回收入到的 细胞特异的 则过柱流出。 细胞特异的cDNA 则过柱流出 如此回收入到的T细胞特异的 被转变为双链cDNA之后，与适当的 噬菌体载体重组 之后， 被转变为双链 之后 与适当的λ噬菌体载体重组 并转染给大肠杆菌寄主细胞，这样便得到了T细胞持 并转染给大肠杆菌寄主细胞，这样便得到了 细胞持 cDNA高度富集的扣除文库。然后再按照同样方法制备 高度富集的扣除文库。 高度富集的扣除文库 扣除的cDNA探针，即被 细胞 探针， 细胞mRNA杂交扣除了的 细 杂交扣除了的T细 扣除的 探针 即被B细胞 杂交扣除了的 胞特异的cDNA探针，筛选文库，结果成功地分离到了 探针， 胞特异的 探针 筛选文库， T细胞的 细胞的TCR基因。 基因。 细胞的 基因 扣除杂交法同样也可以用来分离缺失突变基因
wenku.baidu.com
3．特点 ． 通常情况下， 通常情况下，在某一细胞中或某一个关键的 发育时间点上有15000种以上的基因在表达。 种以上的基因在表达。 发育时间点上有 种以上的基因在表达 如此众多种类的mRNA逆转录产物经 逆转录产物经PCR选 如此众多种类的 逆转录产物经 选 择性扩增后其类型依然众多， 择性扩增后其类型依然众多，很难用电泳系 统加以快速准确地分离。 统加以快速准确地分离。因而需要对逆转录 产物的cDNA进行归类处理，减轻不同 进行归类处理， 产物的 进行归类处理 减轻不同PCR 产物电泳分离的难度，提高分离的准确率。 产物电泳分离的难度，提高分离的准确率。 该方法就具有快速、灵敏和重复性好等优点。 该方法就具有快速、灵敏和重复性好等优点。
基 因 工 程 原 理 与 应 用
差异显示技术及其应用
第一节 mRNA差异显示技术 差异显示技术 第二节 扣除杂交技术 第三节 代表性差异分析技术 第四节 抑制性衰减杂交技术 第五节 基因表达系列分析 第六节差异显示技术的应用
mRNA差异显示技术 差异显示技术(mRNA differential 差异显示技术 display PCR, mRNA DD-PCR)是由 是由Peng Liang 是由 等人在1992年建立的筛选基因差异表达的有效方 年建立的筛选基因差异表达的有效方 等人在 逆转录技术和PCR技术相结合 法。它是将mRNA逆转录技术和 它是将 逆转录技术和 技术相结合 的一种RNA指纹图谱技术。每一种组织细胞(包括 指纹图谱技术。每一种组织细胞 包括 的一种 指纹图谱技术 同一组织细胞经过不同的处理)都有其特异表达的 同一组织细胞经过不同的处理 都有其特异表达的 不同于其他组织细胞的基因谱，即特异的RNA指 不同于其他组织细胞的基因谱，即特异的 指 纹图谱。 纹图谱。
2．实验流程 ． 图略 组织样品总RNA的提取 去除 的提取→去除 组织样品总 的提取 去除RNA样品中的 样品中的 微量DNA→设计引物序列 逆转录归类反应 设计引物序列→逆转录归类反应 微量 设计引物序列 体系的建立→PCR选择性扩增 选择性扩增→mRNA DD体系的建立 选择性扩增 PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 差异 产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳→差异 产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 表达条带的回收→回收条带的再次扩增 回收条带的再次扩增→二 表达条带的回收→回收条带的再次扩增→二 次扩增产物的克隆、测序和GenBank查询 次扩增产物的克隆、测序和 查询 →Northern Blot和 Dot Blot杂交。 杂交。 和 杂交
4．应用 ． mRNA DD-PCR技术是筛选和克隆差异表达 技术是筛选和克隆差异表达 基因的一种快速而行之有效的方法。 基因的一种快速而行之有效的方法。
差异显示技术及其应用
第一节 mRNA差异显示技术 差异显示技术 第二节 扣除杂交技术 第三节 代表性差异分析技术 第四节 抑制性衰减杂交技术 第五节 基因表达系列分析 第六节差异显示技术的应用
第二节 扣除杂交技术 扣除杂交法的本质是除去那些普遍共同存在的、 扣除杂交法的本质是除去那些普遍共同存在的、 或是非诱发产生的cDNA序列，从而使欲分离的目的 序列， 或是非诱发产生的 序列 基因的序列得到有效的富集，提高了分离的敏感性。 基因的序列得到有效的富集，提高了分离的敏感性。 下面以T 细胞受体（ 下面以 细胞受体（T-cell receptor，TCR；有 ， ； 时亦称之为T细胞抗原受体）编码工因的分离为例子， 时亦称之为 细胞抗原受体）编码工因的分离为例子， 细胞抗原受体 说明扣除杂交筛选法的基本原理与简要过程。 说明扣除杂交筛选法的基本原理与简要过程。
cDNA-RDA技术的局限性在于：（1）得到的 技术的局限性在于：（ ） 技术的局限性在于：（ 差异片段是平均为300~600bp的小片段。（ ）由 的小片段。（ 差异片段是平均为 的小片段。（2） 较基因组DNA短，消化后可造成 于cDNA较基因组 较基因组 短 消化后可造成cDNA序 序 列两端信息量丢失。（ 。（3） 列两端信息量丢失。（ ）完全无酶切位点的片段 无法参与RDA筛选。（ ）在极低拷贝差异基因的 筛选。（ 无法参与 筛选。（4） 筛选上进行了改进，但仍有不足。 筛选上进行了改进，但仍有不足。
差异显示技术及其应用
用这12种引物分别对同一总 样品进行cDNA合成， 合成， 用这 种引物分别对同一总RNA样品进行 种引物分别对同一总 样品进行 合成 即进行12次不同的逆转录反应 从而使逆转录的cDNA 次不同的逆转录反应， 即进行 次不同的逆转录反应，从而使逆转录的 具有12种类型 也就是对cDNA进行 种归类 目前较 种类型， 进行12种归类 具有 种类型，也就是对 进行 种归类(目前较 为流行的是进行4种归类 种归类， 为流行的是进行 种归类，即3'端引物采用 端引物采用 oligo(dT)12M, M为A、C、G中的任何一种 。5'端引物 中的任何一种)。 端引物 为 、 、 中的任何一种 采用20条由 个碱基组成的随机引物。对每一类cDNA 条由10个碱基组成的随机引物 采用 条由 个碱基组成的随机引物。对每一类 进行随机引物和逆转录引物PCR扩增，通过对不同的组 扩增， 进行随机引物和逆转录引物 扩增 /细胞或经不同处理的同一组织 /细胞的同一类 细胞的同一类cDNA 织/细胞或经不同处理的同一组织 /细胞的同一类cDNA 选择性扩增产物的凝胶电泳分析， 的PCR选择性扩增产物的凝胶电泳分析，从而反映出不 选择性扩增产物的凝胶电泳分析 同样品的基因在时间和空间上的组织特异性表达。 同样品的基因在时间和空间上的组织特异性表达。简述 其基本原理，就是将基因背景相同的2个或几个细胞系 其基本原理，就是将基因背景相同的 个或几个细胞系 或组织mRNA逆转录成 逆转录成cDNA，用不同引物对，进行 或组织 逆转录成 ，用不同引物对， PCR扩增，扩增时加人同位素标记的核苷酸。用测序胶 扩增， 扩增 扩增时加人同位素标记的核苷酸。 电泳分离PCR产物，经放射自显影即可找到被扩增的差 产物， 电泳分离 产物 异表达的基因。 异表达的基因。
其优势为：（ ）高效性， 其优势为：（1）高效性，与传统的消减富集 ：（ 相比，更加敏感， 相比，更加敏感，可以筛选出低拷贝的差异基因 ；（2）可靠性，结果重复性好， ；（ ）可靠性，结果重复性好，假阳性率非常低 等结合cDNA-RDA和膜杂交筛选，对比 和膜杂交筛选， 。Chang等结合 等结合 和膜杂交筛选 正常人口腔黏膜上皮和HPV永生化的口腔上皮细 正常人口腔黏膜上皮和 永生化的口腔上皮细 胞系，获得了384个差异表达的克隆，并证实其中 个差异表达的克隆， 胞系，获得了 个差异表达的克隆 种差异基因。 含69种差异基因。 种差异基因
差异显示技术及其应用
第一节 mRNA差异显示技术 差异显示技术 第二节 扣除杂交技术 第三节 代表性差异分析技术 第四节 抑制性衰减杂交技术 第五节 基因表达系列分析 第六节差异显示技术的应用
第三节 代表性差异分析技术 （RDA） ） 原理是首先用DpnⅡ或Sau3AI酶切两组双链 原理是首先用 Ⅱ 酶切两组双链 cDNA，两端接上单链接头 ，补平后，用含接头 ，两端接上单链接头R，补平后， R序列的引物扩增，再用 序列的引物扩增， 序列的引物扩增 再用DpnII或Sau3AI去除双 或 去除双 两端的接头R；只给予实验组双链cDNA 链cDNA两端的接头 ；只给予实验组双链 两端的接头 两端再接上单链接头J。将实验组与驱动组cDNA 两端再接上单链接头 。将实验组与驱动组 杂交， 杂交，杂交反应体系中只有实验组自身杂交形成 的双链cDNA才两端都带接头 ，补平后可被含有 才两端都带接头J， 的双链 才两端都带接头 接头J序列的引物几何级扩增 序列的引物几何级扩增， 接头 序列的引物几何级扩增，而只有一端带接 的杂交体只能被线性扩增。 头J的杂交体只能被线性扩增。将此杂交产物再 的杂交体只能被线性扩增 进行第二轮酶切、加接头、杂交和PCR扩增，重 扩增， 进行第二轮酶切、加接头、杂交和 扩增 复两次后， 复两次后，可确保从实验组中彻底去除与驱动组 共有的序列。 共有的序列。