实验九 植物原生质体的分离和培养

实验九植物原生质体的分离和培养
实验目的
掌握植物原生质体分离和培养的基本方法，并对培养的结果进行初步观察。

实验原理
原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。

在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂，并再生成完整植株。

植物的幼嫩叶片、子叶、下胚轴、未成熟果肉、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原生体的材料来源。

分离愿生厦籀萨采用酶解法。

其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。

原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组麟，以及原生质体收集方法有关。

酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。

渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。

酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。

游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯既，然后进行培养。

实验用品
一、材料
1.烟草幼苗的叶片、或向日葵无菌苗的叶片、子叶或下胚轴等。

2.胡萝卜根切片诱导的松软愈伤组织。

二、器材
超净工作台、台式离心机或手摇离心机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、血细胞计数板、石蜡膜带等。

细菌过滤器和0·45µm的滤膜、300目不锈钢网筛及配套的小烧杯、解剖刀、尖头镊子、注射器(5、10m1)和12号长针头、带皮头的刻度移液管(5、10ml，上部管口加棉塞)、培养皿(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、大培养皿、吸水纸等、使用前需经过灭菌。

三、试剂
1. 70％酒精。

2. 0.1％升汞水溶液，并滴入少许TWeen 80。

3. 灭菌蒸馏水。

4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），
PH5.8~6.2。

5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~
6.2。

6. 酶液A
纤维素酶(cellulase，Onozuka R-10 2％
果胶酶(13ectinase，Serva) 1 %
(若用国产EA3-867纤维索酶，则果胶酶可省去。

)
甘露醇0.6 mol／L
CaCl2·2H2O 0.05 mol／L
MES 0.1％
pH 5．8～6．2 7．酶液B
纤维素酶(Onozuka R-10) 2％
离析酶(Macerozyme R-10) 1％
半纤维素酶(hemicellulase，Sigma) 0.2％
甘露醇0.4 mol／L CaCl2·2H20 0.1％
MES PH5.8～6.2 8．DPD培养基(表22-1)
表22-1 DPD培养基
9．C81V培养基(表22-2)
表22-2 C81V培养基
10. 0.1％酚藏花红(配在0.4 mol／L甘露醇中)。

11. 0.01％荧光增白剂(配在0.3 mol／L甘露醇中)。

(3、4、5用高压灭菌，6、7、8、9用过滤灭菌。

)
实验方法
一、叶肉原生质体的分离和培养
1. 取充分展开的叶片，用自来水冲洗干净。

(以下步骤均在超净台上进行)。

2. 将叶片在0·1％升汞溶液中浸泡灭菌10min，中间摇动几次。

取出后用无菌蒸馏水
漂洗5次
3. 将叶片移入大培养皿中，用吸水纸吸去上面的水珠。

然后将叶背面朝上，小心用镊
子撕去下表皮。

4. 将撕去下表皮后的叶片放进预先放有酶液A的培养皿或带盖兰角瓶中，每10ml酶
液约放2g叶片。

若叶片不易撕下下表皮，可用锋利的解剖刀将叶片切成约0.5mm宽的小条，放入酶液。

5. 将培养皿用石蜡膜带封口，在28℃条件下保温3～6h，中间轻轻摇动2～3 。

在倒
置显微镜下检查，直到产生足够量的原生质体。

6. 将酶解后的原生质体悬浮液用不锈钢网筛过滤到小烧杯中，以除去未酶解完全的组
织。

7. 将滤液分装在刻度离心管中，用600r／min的速度离心5min，使原生质体沉淀下来。

8. 用移液管吸去上清液。

将沉淀的原生质体悬浮在2ml 0.2 mol／L的CaCl2·2H2O中。

9. 用注射糙生长针头)向离心簧生部缓缓注入20％蔗糖溶液6ml，在600r／min下离心
5min。

此步完成后，在两相溶液的界面之间将出现一层纯净的完整原生质体带，杂
质，碎片将沉到管底。

10. 注射器吸出管底杂质和下部的蔗糖溶液及上部的CaCI2·2H2O溶液。

11. 离心管中留下的纯净原生质体用8ml 0.2 mol／L的CaCl2·2H2O悬浮。

离心离心5min，
吸去上清液。

再用培养基如法洗涤一次。

12. 将收集的原生质体悬浮在适量DPD培养基中，将其密度调整到5X104／m1左右(可
用血细胞计数板统计原生质体的密度)。

13. 用皮带头的刻度移液管将原生质体悬液分装在培养皿中，每皿放2m1。

14. 用石蜡膜带封口。

置26℃左右条件下进行暗培养。

二、愈伤组织原生质体的分离和培养
1. 胡萝卜松软愈伤组织的诱导和保存
(1) 取田间生长两个月左右的植株的根，用自来水冲洗干净。

(2) 在70％酒精中浸泡2min，取出后放在0.1％升汞溶液中浸泡10min。

再用灭菌蒸
馏水换洗5次。

(以下操作在超净工作台上进行)
(3) 在大培养皿中用解剖刀切取根中央部分，并切成3～5mm厚的横切片。

(4) 将切片摆放在含2mg／L 2，4-D、0.2mg／L激动素和500mg／L。

水解酪蛋白的
MS培养基上。

在26℃左右条件吓进行暗培养，诱导愈伤组织。

(5) 培养2周以后，用镊子将外植体周围形成的愈伤组织取下转移到新鲜培养基上。

(6) 连续继代培养多次，每三周转移一次。

待愈伤组织成为松软状态便可用于分离原
生质体。

2. 取转代培养一周左右，并处于旺盛生长期的愈伤组织，直接放在酶液B中，每10ml酶
液放2g左右。

在室温下保温过夜，或26℃下保温6h以上，直到产生足够量的原生质体。

3. 将酶解后的原生质体悬液用不锈钢网筛过滤，除去未完全消化的组织。

4. 向过滤液中加入等体积的0.16 rnol／L CaCl2·2H2O溶液，混合之后转移到带盖离心管
中。

5. 吸去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在2ml 0.16 rnol／L CaCl2·2H2O溶液中。

6. 用注射器向离心管底部缓缓注入12％蔗糖溶液6ml，然后离心5～10min。

两相溶液界
面间应出现纯净原生质体带，管底出现杂质沉淀。

7. 将注射器插入管底，吸出沉淀的杂质。

并吸出下部蔗糖液及上部钙液。

8. 用0.16 mol／LCaCl2·2H2O悬浮，离心一次，再用C81V培养基如法洗涤一次。

9. 用C81V培养基培养，其操作同叶片原生质体培养。

三、培养结果观察
1．活力检查
凡是活力的原生质体均呈现圆球行，在显微镜下可观察到明显的胞质环流运动。

在叶肉原生质体中由于叶绿体的阻挡，看不清胞质环流。

可取一滴原生质体悬液放在载波片上，加一漓0.1％酚藏花红溶液，凡生活的原生质体均不着色，而死去的原生质体立即着染成红色。

2. 细胞壁再生的观察
培养24～28h后，大部分原生质体已再生新壁。

并且体积增表，变成椭圆形。

可用以下方法别细胞壁的再生。

（1）取一滴原生质体培养悬液放在载波片上，加一滴高浓度（25％）蔗糖溶液，有壁的细胞将发生质壁分离。

（2）取一滴原生质体培养悬液放在载玻片上，加一滴0.01％荧光增白剂溶液。

在荧光显微镜下，当用366nm波长的紫外光照射时，细胞壁将发黄绿色荧光。

3. 细胞分裂的观察
培养4天以后，将出现第一次分裂，可在倒置显微镜下观察。

在培养8～10天后，应统计分裂频率，即出现分裂的原生质体占成活原生质体的百分率。

一般在细胞团形成后(大约在培养的15~20天)，应向培养瓶中补加渗透剂减半的新鲜培养基，以促进细胞团的增殖。

待小愈伤组织形成后，转移到固体培养基上，进行植株分化的条件试验。

思考题
1. 酶解液以及原生质体起始培养液中，为何要保持较高的渗透压？
2. 为何在培养一段时间后，需向培养瓶补加降低渗透压的新鲜培养基?
3. 如何判断分离原生质体的活力和新壁再生?。