实验九 植物原生质体的分离和培养

实验九植物原生质体的分离和培养

实验目的

掌握植物原生质体分离和培养的基本方法，并对培养的结果进行初步观察。

实验原理

原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂，并再生成完整植株。

植物的幼嫩叶片、子叶、下胚轴、未成熟果肉、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原生体的材料来源。

分离愿生厦籀萨采用酶解法。其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组麟，以及原生质体收集方法有关。酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯既，然后进行培养。

实验用品

一、材料

1.烟草幼苗的叶片、或向日葵无菌苗的叶片、子叶或下胚轴等。

2.胡萝卜根切片诱导的松软愈伤组织。

二、器材

超净工作台、台式离心机或手摇离心机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、血细胞计数板、石蜡膜带等。

细菌过滤器和0·45µm的滤膜、300目不锈钢网筛及配套的小烧杯、解剖刀、尖头镊子、注射器(5、10m1)和12号长针头、带皮头的刻度移液管(5、10ml，上部管口加棉塞)、培养皿(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、大培养皿、吸水纸等、使用前需经过灭菌。

三、试剂

1. 70％酒精。

2. 0.1％升汞水溶液，并滴入少许TWeen 80。

3. 灭菌蒸馏水。

4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），

PH5.8~6.2。

5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~

6.2。

6. 酶液A

纤维素酶(cellulase，Onozuka R-10 2％

果胶酶(13ectinase，Serva) 1 %

(若用国产EA3-867纤维索酶，则果胶酶可省去。)

甘露醇0.6 mol／L

CaCl2·2H2O 0.05 mol／L

MES 0.1％

pH 5．8～6．2 7．酶液B

纤维素酶(Onozuka R-10) 2％

离析酶(Macerozyme R-10) 1％

半纤维素酶(hemicellulase，Sigma) 0.2％

甘露醇0.4 mol／L CaCl2·2H20 0.1％

MES PH5.8～6.2 8．DPD培养基(表22-1)

表22-1 DPD培养基

9．C81V培养基(表22-2)

表22-2 C81V培养基

10. 0.1％酚藏花红(配在0.4 mol／L甘露醇中)。

11. 0.01％荧光增白剂(配在0.3 mol／L甘露醇中)。

(3、4、5用高压灭菌，6、7、8、9用过滤灭菌。)

实验方法

一、叶肉原生质体的分离和培养

1. 取充分展开的叶片，用自来水冲洗干净。(以下步骤均在超净台上进行)。

2. 将叶片在0·1％升汞溶液中浸泡灭菌10min，中间摇动几次。取出后用无菌蒸馏水

漂洗5次

3. 将叶片移入大培养皿中，用吸水纸吸去上面的水珠。然后将叶背面朝上，小心用镊

子撕去下表皮。

4. 将撕去下表皮后的叶片放进预先放有酶液A的培养皿或带盖兰角瓶中，每10ml酶

液约放2g叶片。若叶片不易撕下下表皮，可用锋利的解剖刀将叶片切成约0.5mm宽的小条，放入酶液。

5. 将培养皿用石蜡膜带封口，在28℃条件下保温3～6h，中间轻轻摇动2～3 。在倒

置显微镜下检查，直到产生足够量的原生质体。

6. 将酶解后的原生质体悬浮液用不锈钢网筛过滤到小烧杯中，以除去未酶解完全的组

织。

7. 将滤液分装在刻度离心管中，用600r／min的速度离心5min，使原生质体沉淀下来。

8. 用移液管吸去上清液。将沉淀的原生质体悬浮在2ml 0.2 mol／L的CaCl2·2H2O中。

9. 用注射糙生长针头)向离心簧生部缓缓注入20％蔗糖溶液6ml，在600r／min下离心

5min。此步完成后，在两相溶液的界面之间将出现一层纯净的完整原生质体带，杂

质，碎片将沉到管底。

10. 注射器吸出管底杂质和下部的蔗糖溶液及上部的CaCI2·2H2O溶液。

11. 离心管中留下的纯净原生质体用8ml 0.2 mol／L的CaCl2·2H2O悬浮。离心离心5min，

吸去上清液。再用培养基如法洗涤一次。

12. 将收集的原生质体悬浮在适量DPD培养基中，将其密度调整到5X104／m1左右(可

用血细胞计数板统计原生质体的密度)。

13. 用皮带头的刻度移液管将原生质体悬液分装在培养皿中，每皿放2m1。

14. 用石蜡膜带封口。置26℃左右条件下进行暗培养。

二、愈伤组织原生质体的分离和培养

1. 胡萝卜松软愈伤组织的诱导和保存

(1) 取田间生长两个月左右的植株的根，用自来水冲洗干净。

(2) 在70％酒精中浸泡2min，取出后放在0.1％升汞溶液中浸泡10min。再用灭菌蒸

馏水换洗5次。

(以下操作在超净工作台上进行)

(3) 在大培养皿中用解剖刀切取根中央部分，并切成3～5mm厚的横切片。

(4) 将切片摆放在含2mg／L 2，4-D、0.2mg／L激动素和500mg／L。水解酪蛋白的

MS培养基上。在26℃左右条件吓进行暗培养，诱导愈伤组织。

(5) 培养2周以后，用镊子将外植体周围形成的愈伤组织取下转移到新鲜培养基上。

(6) 连续继代培养多次，每三周转移一次。待愈伤组织成为松软状态便可用于分离原

生质体。

2. 取转代培养一周左右，并处于旺盛生长期的愈伤组织，直接放在酶液B中，每10ml酶