组织中乳酸脱氢酶同工酶的活性染色
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蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素 电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同 2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型 凝胶系统的均匀性（连续性系统、非连续性系统） 凝胶形状（圆盘状电泳、平板电泳） 被分离物质是否变性（非变性、变性） 3. SDS-PAGE 过程有浓缩效应和分子筛效应 浓缩效应：电泳开始后，由于快离子的泳动率最大，在快离子后面就形成了一个离子浓度低的区域，即低电导区。低电 导区产生了较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。 由于样品中蛋白质的有效泳动率恰好在快慢离子中间，结果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一层薄 膜 分子筛效应：蛋白质样品进入分离胶（小孔胶）后 pH 增大(pH 8.9 Tris-HC1)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之 分，蛋白质样品在均一电场强度和 pH 条件下泳动。 由于各种蛋白质分子量不同，因此质点的有效迁移率不同，形成不同区带。
LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，它们均具有 LDH 催化活性，从而首先提出了同工酶的概念。目前已知 LDH 同工酶 是由 H 和 M 亚基按不同比例组成的四聚体。
实验原理及目的
实验目的 1. 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和有关同工酶的知识 2. 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳糖脱氢酶同工酶及底物染色的操作技术 实验原理 1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂 N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素和加速剂(TEMED)作 用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶，通过改变凝胶浓度(T)及交联度(C)来调节凝胶的孔径，具有良好的分子筛效 应。
凝胶的总质量浓度 T 和交联度 C 决定凝胶的有效孔径。凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，不同大小和形状的大 分子通过孔径时所受的阻滞力不同，加上大分子的电荷效应，使各种大分子迁移率不同得以分离。在实际工作中，常依 据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度，使蛋白质混合物得到最大限度的分离，大多数蛋白 质在 7.5%凝胶中能得到满意的结果，所以这个浓度的凝胶称为标准胶。当分析一个未知样品时，常用标准胶或梯度凝胶 来测试，而后确定适宜的凝胶浓度。
实验步骤
1. 样品制备 断脊椎处死小鼠，取小鼠骨骼肌、肝脏、心肌和脑组织各 100mg，加入 5 倍组织重的匀浆缓冲液，用玻璃匀
浆器匀浆，离心(10000 r /min，15 min)，吸出上清液，加入等体积上样缓冲液，混匀，放置 4℃冰箱中备用。 2. 制备凝胶 3.加缓冲液
（1）在电泳槽中加入电泳缓冲液，注意内槽液要高过凹形板，凝胶板与外液槽的缝隙处无气泡。 （2）小心去掉梳子，注意样品孔内不要留有气泡。 (3)加缓冲液，一定避免凝胶下端两玻璃板间形成气泡，如果产生气泡，一定清除，以保证电流的通畅。
生命与环境科学学院实验报告
实验课名称 生物化学实验 实验名称 组织中乳酸脱氢酶同工酶的活性染色 成绩______________
姓名 王大锤 年级
学号
组别
时间
温度 24.2℃ 压强 101.5kPa
实验结果பைடு நூலகம்
略
分析讨论
根据以上实验结果，可以看出在小鼠的肝、心肌、脑、骨骼肌、血清 5 种组织中，同工酶 LDH1、LDH2、 LDH3、LDH4、LDH5 的含量有所不同，心肌中 LDH1 的含量最高，骨骼肌和肝脏中的 LDH5 含量最高
4.加样 使用移液器加样时，动作一定要缓慢，尽量避免产生气泡；注意加样时使用同一支移液器，以免产生误差。 5.电泳 加样后，浓缩胶部分以恒压 80V 进行电泳，待样品进入分离胶后，电压提高到 120V，继续电泳，直到溴酚蓝前沿 到达距凝胶下端约 0.5cm 时，关闭电源（本实验可将溴酚蓝走出 0.5h-1h 后停止电泳）。 6.染色、脱色、拍照 1）电泳结束后，将凝胶板取出，用薄尺轻轻将玻璃板撬开，在凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位； （2）然后将凝胶板反扣过来，胶面朝下，用尺子将凝胶的一角剥离，直到凝胶完全掉入装有活性染色液的培养皿 中。 （3）轻轻摇动培养皿，使凝胶完全浸泡在染色液中，放入 37℃恒温水浴中保温，染色过程注意避光，待大多数 条带显现蓝紫色时除去染色液，显色时间一般为 10-40 min。 （4）加入脱色液终止酶促反应，摇动 3-5 min，凝胶底色脱去直至背景清亮，数码相机照相。
生命与环境科学学院实验报告
实验课名称 生物化学实验 实验名称 组织中乳酸脱氢酶同工酶的活性染色 成绩______________
姓名 王大锤 年级
学号
组别
时间
温度 24.2℃ 压强 101.5kPa
4. 关于乳酸脱氢酶同工酶 1959 年 Markert 等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱氢酶(LDH)分离出 5 条区带，由阳极到阴极依次命名为
实验步骤
实验试剂仪器和器材
试剂 1、PAGE 试剂 （1）30%凝胶贮液 （2）分离胶缓冲液 （3）浓缩胶缓冲液 （4）10% AP （5）TEMED （6）电极缓冲液 （7）上样缓冲液 2、LDH 同工酶染色液 3、脱色液: 2%乙酸 4、组织匀浆液
器材 稳压、恒流电泳仪，垂直板电泳槽，移液管，移液枪，烧杯，培养皿，凝胶成像仪
LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，它们均具有 LDH 催化活性，从而首先提出了同工酶的概念。目前已知 LDH 同工酶 是由 H 和 M 亚基按不同比例组成的四聚体。
实验原理及目的
实验目的 1. 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和有关同工酶的知识 2. 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳糖脱氢酶同工酶及底物染色的操作技术 实验原理 1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂 N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素和加速剂(TEMED)作 用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶，通过改变凝胶浓度(T)及交联度(C)来调节凝胶的孔径，具有良好的分子筛效 应。
凝胶的总质量浓度 T 和交联度 C 决定凝胶的有效孔径。凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，不同大小和形状的大 分子通过孔径时所受的阻滞力不同，加上大分子的电荷效应，使各种大分子迁移率不同得以分离。在实际工作中，常依 据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度，使蛋白质混合物得到最大限度的分离，大多数蛋白 质在 7.5%凝胶中能得到满意的结果，所以这个浓度的凝胶称为标准胶。当分析一个未知样品时，常用标准胶或梯度凝胶 来测试，而后确定适宜的凝胶浓度。
实验步骤
1. 样品制备 断脊椎处死小鼠，取小鼠骨骼肌、肝脏、心肌和脑组织各 100mg，加入 5 倍组织重的匀浆缓冲液，用玻璃匀
浆器匀浆，离心(10000 r /min，15 min)，吸出上清液，加入等体积上样缓冲液，混匀，放置 4℃冰箱中备用。 2. 制备凝胶 3.加缓冲液
（1）在电泳槽中加入电泳缓冲液，注意内槽液要高过凹形板，凝胶板与外液槽的缝隙处无气泡。 （2）小心去掉梳子，注意样品孔内不要留有气泡。 (3)加缓冲液，一定避免凝胶下端两玻璃板间形成气泡，如果产生气泡，一定清除，以保证电流的通畅。
生命与环境科学学院实验报告
实验课名称 生物化学实验 实验名称 组织中乳酸脱氢酶同工酶的活性染色 成绩______________
姓名 王大锤 年级
学号
组别
时间
温度 24.2℃ 压强 101.5kPa
实验结果பைடு நூலகம்
略
分析讨论
根据以上实验结果，可以看出在小鼠的肝、心肌、脑、骨骼肌、血清 5 种组织中，同工酶 LDH1、LDH2、 LDH3、LDH4、LDH5 的含量有所不同，心肌中 LDH1 的含量最高，骨骼肌和肝脏中的 LDH5 含量最高
4.加样 使用移液器加样时，动作一定要缓慢，尽量避免产生气泡；注意加样时使用同一支移液器，以免产生误差。 5.电泳 加样后，浓缩胶部分以恒压 80V 进行电泳，待样品进入分离胶后，电压提高到 120V，继续电泳，直到溴酚蓝前沿 到达距凝胶下端约 0.5cm 时，关闭电源（本实验可将溴酚蓝走出 0.5h-1h 后停止电泳）。 6.染色、脱色、拍照 1）电泳结束后，将凝胶板取出，用薄尺轻轻将玻璃板撬开，在凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位； （2）然后将凝胶板反扣过来，胶面朝下，用尺子将凝胶的一角剥离，直到凝胶完全掉入装有活性染色液的培养皿 中。 （3）轻轻摇动培养皿，使凝胶完全浸泡在染色液中，放入 37℃恒温水浴中保温，染色过程注意避光，待大多数 条带显现蓝紫色时除去染色液，显色时间一般为 10-40 min。 （4）加入脱色液终止酶促反应，摇动 3-5 min，凝胶底色脱去直至背景清亮，数码相机照相。
生命与环境科学学院实验报告
实验课名称 生物化学实验 实验名称 组织中乳酸脱氢酶同工酶的活性染色 成绩______________
姓名 王大锤 年级
学号
组别
时间
温度 24.2℃ 压强 101.5kPa
4. 关于乳酸脱氢酶同工酶 1959 年 Markert 等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱氢酶(LDH)分离出 5 条区带，由阳极到阴极依次命名为
实验步骤
实验试剂仪器和器材
试剂 1、PAGE 试剂 （1）30%凝胶贮液 （2）分离胶缓冲液 （3）浓缩胶缓冲液 （4）10% AP （5）TEMED （6）电极缓冲液 （7）上样缓冲液 2、LDH 同工酶染色液 3、脱色液: 2%乙酸 4、组织匀浆液
器材 稳压、恒流电泳仪，垂直板电泳槽，移液管，移液枪，烧杯，培养皿，凝胶成像仪