船舶压载水公约要求下的压载水中微生物的检测分析

该法是 通过测量微生物代谢引起培养 基的电特性变化来 测定样品微生物含量。微生物在培养过程中，由于新陈代谢， 使培养基中的大分子电惰性物质，如碳水化合物、 类脂、 蛋 白质等， 转化为小分子的电活性物质， 如乳酸盐、醋酸盐、 重碳酸盐 等，从而使培养基导电性增强 ，电阻抗降低。研究 表明，电 导率随时间的变化曲线与微生 物生长曲线相似，出 现缓慢增 长期、加速增长期、指数增长 期和缓慢减少期，最 后趋于稳 定期。微生物起始数量不同， 出现指数增长期的时 间也不同 ，通过建立二者之间的关系， 就能通过检测培养基 电特性变 化推演出微生物的原始数量。 电阻抗法可采用自动 连续性检 测，能同时检测多个样品的微 生物量，具有在线快 速、准确 的特点，具有较好的应用前景 。但该法成本相对偏 高，受培 养基变化等干扰因素影响也较 大，且无法区分碎片 和细胞。
第 11 卷 第 8 期 2011 年 8 月
中国水运 Chi na Wat er Tr a ns por t
Vol . 11 Augus t
No. 8 2011
船舶压载水公约要求下的压载水中微生物的检测分析
傅志超
（中华人民共和国辽宁海事局，辽宁 大连 1 1 6001 ）
摘 要：文中结合压载水的处理性能标准，综述 了现有海洋微生物的检测分析技术。在此基础上，提出采用微流体
3．库尔特（Coulter）法 库尔特 法是利用电阻变化法测定细胞 数量。这种方法的 原理是将 待测样品与缓冲液混合，制成 稀释的悬浮液，然后 将此悬浮 液从一个口径已定的小孔抽入 另外一个小孔管内， 小孔两侧 各有一个电极，当颗粒通过小 孔时，每一颗粒取代 了等体积 的电解液，使两极间的电阻即 电位差呈现暂时性的 改变，电 脉冲个数即为颗粒的个数，而 电脉冲的幅值则反映 了颗粒的尺寸。库尔特（C ou lt er ）法在测定颗粒大小的同时 也测定对应样品体积内颗粒的数量，可算出微生物的数量。 4．显微摄影和幻灯测量法 在落射 荧光显微镜上加照相机可在测 定微生物数量的同 时测定微 生物的大小，称之为显微摄影 法。显微摄影法、幻 灯测量法 是在显微镜对微生物细胞放大 的基础上，对样品进 行拍照以 测定其大小与数量，然后计算 其体积。通常是使用 感光率好的胶卷去拍照 5~ 10 视野的微生物细胞数。根据过 滤在膜上 的水样体积、视野面积和滤膜 过滤面积三者的关系 可以推算 出水体微生物的数量。在测定 微生物细胞大小时， 测定 AO 染色的细胞大小可能比 D API 染色的细胞大。因为 DAPI 只能染色 DNA，AO 不仅可以染色 DNA，还可以染色 R NA，故用 AO 染色的细胞荧光强度比较大，拍照的细胞显 得更大。 应用荧光显微镜测定微生物大 小和数量的方法是目 前实验室中最为常用的方法。
收稿日期：2 01 1- 0 5- 26 作者简介：傅志超（1 97 8- ），男，中华人民共和国辽宁海事工程师，主要从事船舶监督和航运公司安全管理体系审核。
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5．光学显微镜计数法 即利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微 生物计数方法，将孢子悬液（或菌悬液）放在血球计数板载玻 片与盖玻片之间的计数室内，由于载玻片上的计数室盖上盖玻 片后的容积是一定的，所以可以根据在显微镜下观察到的微生 物数目换算为单位体积内的微生物数目。该方法克服了非藻颗 粒物的干扰，计数结果更接近真实值，但工作强度大、效率低， 同时要求实验人员必须具备丰富的水生生物学知识，能鉴定、 识别常见藻类，人为因素影响和误差较大，线性范围较小，重 现性不够好，所测粒径范围受到显微镜本身放大倍数的局限， 对微型浮游植物及超微型浮游植物严重漏检。 6．荧光显微镜计数法 荧光显微镜技术的应用使生物的观察、鉴定和分析进入了 一个新的时代。目前，荧光显微镜计数法主要包括荧光染料直 接计数法、荧光原位杂交计数法和荧光免疫染色计数法等。 （1 ）荧光染料直接计数法。在生物染色剂中，有一类可 被激发而发射 荧光的染料，统称为荧光染 料。常见的荧光染 料直接计数法有 AO 染色法和 DAP I 染色法。荧光染料直接 计数法快速、 准确、简便，且样品易于保 存，用于水体中微 生物总数测定能较好反映样品中生物的实际数量。 （2 ）荧光原位杂交计数法。荧光原位 杂交（F IS H）技 术是近年来生 物学领域发展起来的一项新 技术。该技术是用 特殊的荧光素标记 DNA 探针，特异性地与互补核酸序列在 完整的细胞内 结合，用荧光显微镜等荧光 检测技术进行观察 和分 析。近 年来随着 FIS H 技 术应用 的探针种 类的不 断增 多，F IS H 技术在细胞遗传学和环境水体中各种生物的检测和 分析等方面得到了广泛应用。 F IS H 计数法具有安全、简便、灵敏、快速，可检测出环 境样品中大多 数的生物，能对不同环境样 品中的生物从系统 发育的角度进 行鉴定，尤其对水生生态系 统中微生物群的系 统发育、定性 、定量检测方面有着独特的 优越性。但值得指 出是： 荧光探针价格昂贵，而且需要专业的分子生物学知识， 在杂交效率、 杂质的干扰、荧光淬灭、清 洗过程中的脱落等 方面都可能影响观测结果的可靠性。 （3 ）荧光免疫计数法。荧光免疫技术（IFT）是一种以 荧光染作为 标记物的免疫分析技术，随 着一系列新仪器和 新方法的建立 ，荧光免疫技术取得了快速 发展，使荧光免疫 技术的标准化 、定量化和自动化进入一个 新的发展阶段。荧 光免疫计数法 是利用抗原和抗体相互作用 的原理，用荧光素 的衍生物标记 特异性抗体，检测微生物细 胞上的抗原，在显 微镜视野下进行荧光点的检测即可得到样品中生物的数量。 7．最可几率数- 聚合酶链式反应计数法（MPN- PC R 法） 近年来，由于分子 生物学的发展，提出了 PC R 技术和 MP N 联 用 技 术 进 行 微 生 物 数 量 测 定 的 新 方 法 ， 称 为 MP N-P CR 法。 PC R 法是一种在体外快速扩增微量靶 DNA 的技术，目前 已广泛地用检测水体及土壤 中的微生物，其方 法为： 对抽提的总 D NA 溶液进行 1 0 倍梯度稀释，选取不 同稀释度的样品分别 进行 P CR 反应 ，根据扩增产物的电泳 结果来计数各样品的阳性反应数，再从 M PN 表中查出生物 的相应近似值，即可推算单位水样中微生物的数量。
芯片检测方法，用于压载水的现场快速检测。本文的研究对于便携式压载水港口国分析仪器具有一定的借鉴价值。
关键词：压载水公约；海洋生物；检测分析；微流体芯片
中图分类号：U663. 85
文献标识码：A
文章编号：1006- 7973（2011）08- 0085- 03
一、前言 随船舶压载水 造成的海洋物种对海洋环境 的侵害，己被 全球环境基金 组织（Globa l En vir on m e n t Fa cilit y）确认 为危害海洋的 四大威胁之一。为有效应对 压载水造成生物入 侵问题，国际海事组织于 2 0 04 年通过了《国际船舶压载水 和沉淀物控制与管理公约》（下述公约）。截止到 2 0 11 年 3 月 31 日，共 有 27 个 国家加 入公约 ，占世界 商船总 吨位 2 5.3 2%，公约有望在今年达到生效条件。 按公约 D 部分的要求，船舶压载水管理的标准有两种： D- 1 标准（压载水交换标准）和 D- 2 标准（压载水处理性能 标准）。D- 1 标准规定了压载水交换的标准，其交换的有效性 可以通过分析 压载水中的各种参数，也可 以通过更换压载水 的流量来确认。D- 2 标准则具体规定了处理过的压载水中的 不同尺寸存活 生物的浓度，当船舶采用处 理技术对压载水排 放前处理时应满足该标准 此外，根据公约 Ar t.9 规定，港口国正式授权的官员有 权根据导则 G2 对到港船舶进行压载水取样并分析，以确认 处理后的压载 水是否满足公约规定的标准 ，但样品分析需要 的时间不能对船舶造成不当的延误。 本文将结合压 载水的处理性能标准，对现 有海洋微生物 的检测分析技 术进行综述。在此基础上， 提出采用微流体芯 片检测方法，用于压载水的现场快速检测。 二、海洋微生物检测技术现状 目前海洋生物 检测技术的主要检测方法有 平板计数法、 溶液电阻抗法、库尔特（Cou lt er ）法、显微摄影法、幻灯测 量法、光学显微镜计数法、荧光显微镜计数法、最可几率数聚合酶链式反应计数法（MP N-P C R 法）、混浊度计数法、流 式细胞仪测定法、分子检测方法和生化活力检测等方法。 1．平板计数法 平板计数法是 检测环境中微生物数量最早 的方法之一， 即把水样接到 平板中进行培养，由平板中 生长出的微生物群 落数量来推算 环境中的微生物数量。这种 方法测定的是可培 养微生物的数量，因此在研究微生物的各种生理生化特性时， 通常使用平板 进行纯培养，但对于检测环 境中所有微生物的 数量，应用这种方法是不合适的。 2．溶液电阻抗法