低极性人参皂苷制备研究进展_刘发贵

关键词 ： 低极性 ； 人参皂苷 ； 制备 ； 抗肿瘤
低 极 性 人 参 皂 苷 如 人 参 皂 苷 Rg3，Rh2 只 存 在 于 野山参 、 红参 、 人参果等 ， 且含量极低 ， 仅为万分之几 。 现代药理学研究证明低极性人参皂苷具有很强的生 理活性 ，如人参皂苷 Rh2 具有高抗癌作用 ，Rg3 具有软 化血管和抗癌功能等 ， 因此低极性人参皂苷具有极高 药用价值和应用前景 。 研究人参皂苷的制备方法 , 对 发现活性更强的成分和研制抗肿瘤新药将具有重 要 的意义 。 为此 ，本文对人参低极性皂苷制备方法的研 究进行综述 。 1 化学水解法 目前人参皂苷化学水解方法主要包括 ： 酸水解 、 碱水解 。 酸水解 ： 如将人参皂苷 Rb1、Rb2 和 Rc 与 7%HCl 的稀乙醇液共热可断裂所有的糖苷键 , 同时发生 C20 羟基和侧链双键的脱水环合 , 生成处于平衡状态的 20(S)- 和 20(R)-PPD 的混合物 。 酸水解可引起苷元结 构发生变化 ， 得不到原苷元 ， 而是主要得到人参二 醇 (panax-diol,PD) 和人参三醇 (panaxatriol,PT) 及 C-20 差 向异构体 [1]。 一般常用 5%硫酸乙醇和 5%HCl 甲醇溶 液水解 4-6h, 再用乙醚萃取得到苷元 。 若将 Rb1 、Rb2 和 Rc 与浓 HCl 在室温下反应 24h ， 则发生侧链的加 氯化氢反应 ， 同时引起 C-20 转位 ， 形成 2 种 C-20 手 性不同的皂苷元氯化氢加成物 ， 再用正丁醇钠 、 叔丁 醇 钾或二乙胺 处理脱去氯 化氢 ， 生成 20(S) 和 20(R)原人参二醇的混合物 ，在 60℃ 酸性条件下水解 5h 后 ， 二醇型皂苷水解生成 20(S)-Rg3 和 20(R)-Rg3， 而在中 性条件下 ， 其中的人参皂苷 Rb1、Rb2 和 Rc 几乎不转
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人参研究
GINSENG RESEARCH
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制而成 ， 使淀粉转变为红糊精 ( 人参颜色变红 ) ， 也产生 了白参不含 有 、 红参具有 的特征性成 分 Rg3、Rh2、20 (R)-Rg2 和 Rh1 等 ， 近年也出现将红参继续加热加工 得到黑参 ， 黑参含有稀有活性成分 Rg6、F4、Rk3、Rh4、 Rg3、Rs3、Rk1、Rg5、Rs5、Rs4 等 。 金凤燮等 [24]人高活性红 参的制作方法为 ： 取新鲜人参 ， 水洗后 以 95℃ ~100℃ 处理 1~10 分 ， 使生人参达到既破坏组织 ， 但人参自身 皂苷酶活性保存 70％~80% ； 在 60℃~90℃ 反应 0.5~1 小时 ； 再升温至 100℃~130℃ 处理 0.5~3 小时转化灭 酶处理后 ， 干燥得到制品 。 所得高活性红参较传统工 艺红参人参皂苷 Rh1、Rh2、Rh4 含量提高 10 倍 ， 人参 皂苷 Rg3 提高 45 倍 ， 人参皂苷 Rg5 提高 15 倍 。 中国 科 学院长春应 用化学研究 所 [25] 中药 红 参 的 加 工 方 法 为将鲜参清洗干净 ， 摆放蒸参箱内 ， 蒸制 4 至 7 小时 。 蒸制后将人参取出 ， 外表涂抹辅料 ， 放入烘干箱 内以 50℃~60℃ 。 大约烘干 4 天后取出 ，得到的红参颜色鲜 艳有光泽 。 利用高效液相色谱方法 (HPLC) 对经本方法 炮制加工的红参进行人参皂苷指标性成分的含 量检 测 ， 皂苷含量并没有下降 。 Re 、Rg1、Rf 、Rb1、Rg2、Re 、 Rb2、Rd、Ro 减少 5%~20% ，20(S)-Rg3 增加 30%~40% 。 并产生了人参中不含有的人参皂苷 Rh1、Rg6、F4、Rk3、 Rh4、20R-Rg3、20S-Rs3、20R-Rs3、Rk1、Rg5。 韩国公开了 大量黑参的加工工艺的发明专利 [26~29]， 如取鲜参 ， 去其 上杂物放入干燥箱中 60℃~70℃ 干燥 8~10h ， 干燥完 成后在高压蒸汽中 95℃~105℃ 蒸 2h ， 蒸完后在 60℃~ 70℃ 干 燥 6~10h ， 重 复 8 次 ， 第 九 次 95℃ ~105℃ 蒸 48h，取出干燥至含水量为 14% ，即得黑参 。 5 化学合成法 自从人参皂苷被确定为人参主要有效成分后 ， 化 学家们便致力于某些单体皂苷的合成 。 如人参皂 苷 Rh2 由于其良好的肿瘤细胞毒活性 ， 许多学者企图探 索其全合成 ， 前苏联学者 [30] 采用从桦树叶中分离的白 桦烯三醇为原料 ， 通过五步区域选择性和立体选择性 反应合成了 Rh2。 韩国学者 [31]则通过原人参二醇与乙 酰溴代葡萄糖的偶联得到该化合物 。 我国学者 [32]也曾 用人参茎叶水解得到的人参二醇和乙酰溴代葡 萄糖 的缩合得到 Rh2。 总的来说 ， 由于皂苷母核结构构型 的复杂性 ， 使得选择性差 ， 中间产物复杂 ， 产率低 ， 到 目前为至 ， 人参皂苷的人工全合成仅停留在探索阶 段 ， 人们大多是利用丰富的现有人参皂苷资源 ， 进行 侧链的修饰和改造 （ 此过程一般称为半合成 ）， 获得活 性更强的化 合物 。 吉林大 学王帅 玉 [33] 通 过 人 参 皂 苷 Rh2 的 硫 酸 化 修 饰 发 现 修 饰 所 得 的 衍 生 物 的 细 胞 毒 性比人参皂苷 Rh2 低 ， 且抗病毒 ， 提高免疫力增强 。 吉 林大学刘继华 [34]通过人参皂苷 Rh2，Rg3 和原人参二醇 的氨基酸修饰发现修饰产物水溶性增强 ， 抗癌活性增 强 。 弓晓杰 [35]在体外对人参皂苷次生代谢产物 M1 的
图-1
人参二醇组皂苷微生物水解产物化学结构图
图-2 人参皂苷微生物发酵产物化学结构图 加热加工法 人参皂苷水溶液在水浴上加热分别 形成相应的 C-20 位去糖基的次级皂苷 。 人参和三七均有在蒸煮 加工后 C-20 位去糖基皂苷收率增大的趋势 ， 说明人 参和三七中这类皂苷成分有相当一部分是在 加工炮 制及提取过程中形成的次级皂苷 。 如红参系白参经蒸
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有限公司曹德榕等 [12] 采用氧气和过氧化物协同作用 ， 通过在醇中原位生成的强碱醇钠碱解人参 属植物的 总皂甙提取物和葫芦科植物的绞股蓝总皂甙提取物 ， 再进过硅胶柱层析纯化得到原人参二醇和原人参三 醇。 2 酶水解法 酶解是一种选择性水解反应 ， 不同种类的酶可作 用于不同构型和不同种类糖的苷键 ， 从而达到水解目 的 。 酶反应具有条件温和 、 高专一性 、 高效性和无污染 等特点 。 酶水解发生在 PPD 型皂苷的 C-3 位与 C-20 位糖基部分 ，PPT 型皂苷的 C-6 位 糖基部分 。 如 Rd 用高峰淀粉酶 (takadiastase) 酶解 ， 得 F2 ， 即水解掉 C-3 位上的末端 β-D- 葡萄糖 , 而保留了 C-3 位内侧及 C20 位上的葡萄糖 ；Rh1 用陈皮苷酶水解可得到 20(S)PPT；Rg3 用粗陈皮苷 酶 (hesperidiase) 水解 产 生 20(S)PPD, 而用纤维素酶 (cellulase) 水解则得到 Rh2。 用粗橙 皮苷酶 、 柚皮苷酶 、 果胶酶水解人参皂苷 Rb1、Rb2、Rc 主要产物为 C-K 和少量的 PPD 。 用商业柚皮苷酶水 解 Rb1、Rb2 最终得到 C-K ， 橙皮苷酶水解 Rg1 得到 F1 (失去 C-6 位糖基 )； 用 β- 半乳糖苷酶 (β-galactosidase) 和 lactase 水解 PPT 型皂苷得到 Rg2 和 Rh1， 橙皮苷酶 水解 Re 生成 Rg1； 用 snailase 水解三七茎叶总皂苷 ， 得到 Mx[13]。 经 β- 葡萄糖苷酶处理 Rb1、Rc 和 Rd 后所 得 Rh2 的收率为人参的 0.5% ， 其收率比红参中的含 量提高 500 倍[14]。 韩颖等 [15]采用生物技术对三七的种 植废弃物 - 三七茎叶中的抗肿瘤成分人参皂苷化合物 K(C-K) 进行转化 。 比较 β-葡聚糖苷酶 、纤维素酶和甘 蔗镰孢霉 (Fusariumsacchari) 对三七茎叶废弃物中总皂 苷的转化作用 ， 以 C-K 为检测目标 ， 优选转化活性 强 、C-K 生成量高的转化方法 。 结果表明 ， 三七茎叶经 甘 蔗 镰 孢 霉 转 化 后 ,C-K 的 产 量 是 原 皂 苷 中 含 量 的 215 倍 ， 是经 β- 葡聚糖 苷酶转化 的 2.3 倍 、 纤维素 酶 转化的 3 倍 。 大连轻工学院金凤燮 [16]课题组对酶法制 备稀有人参皂苷进行较为系统的研究 ， 取得了非常有 意义的成果 。 用人参二醇型皂苷为底物 ， 以人参皂苷 β- 葡萄糖苷酶为生物催化剂 ， 经酶处理和其它反应 后人参皂苷 Rh2 的收率为人参的 0.5% ， 其收率比红 参 中 提 高 500 倍 。 副 产 物 为 人 参 皂 苷 Rg3、Rg5、Rh1、 Rh3、 人参二醇型皂苷元 ， 经硅胶柱分离得到酶解产 物 。 金凤燮教授发明的 “ 酶转化法生产 Rh2 等人参稀 有皂苷 ”， 在 2003 年度国家科学技术奖励大会上 ， 获 得国家技术发明二等奖 。 3 微生物发酵法 微生物转化是利用微生物细胞产生 的一种或多 种酶把一种化合物变成结构相关的更有经济 价值的 产物 , 来完成常规化学方法难以实现的生化反应 , 其本 质是利用微生物本身所产生的酶对外源底 物进行的
催化反应 。 Dongaling 等 [17]报道了利用 49 种微生物菌 株对人参皂苷 Rg1， 进行生物转化研究 ， 发现其中只有 小 型 丝 状 真 菌 黑 曲 霉 (Aspergillusniger3.1858) 与 蓝 色 梨头霉 (Absidiacoerulea3.3538) 具有转 化能力 ， 经正 交 试验优化转化条件 ， 放大培养 ， 制备得到产物 MT1 ， 与 MT2， 经化学与波谱技术鉴定 ，MT1 与 MT2 为同一产 物即人参皂苷 Rh1。 吴秀丽等 [18]采用固体与液体发酵 培养法 , 从 325 株 真 菌 中 筛 选 到 能 对 单 体 人 参 皂 苷 Rg1 进行生物转化的菌株 。 采用 1H-NMR 、13C-NMR 波谱手段及 理化性质鉴 定人参皂苷 Rg1 及 其 转 化 产 物 。 结果发现真菌菌株 EST-Ⅰ 与 EST-Ⅱ将人参皂苷 Rg1 定向转化为 人参皂苷 F1 ， 说 明两种菌株 能 产 生 特异性水解 C-6 位葡萄糖的 β- 葡萄糖苷酶 。 藏韫霞 等 [19] 对 11 种微生物转化人参中的人参皂苷进行了研 究 ， 选择直接发酵和酸处理后发酵两种方法 ， 筛 选到 了生物转化优良菌株 GY06 。 经形态学和 ITS 序列测 定 ，GY06 属 于 青 霉 属 ， 且 认 为 是 接 近 于 扩 展 青 霉 Penicilliumexpansum 。 探讨了扩展青霉发酵人参浸出 物的方法 ， 先用 1mol/LHCl 水解 2~4h ， 再利用扩展 青 霉发酵酸水解后的人参浸出物 ， 结果部分人参皂苷转 化为 Rh2。 吉林农业大学张连学等 [20~21] 以人参二醇组 皂苷利用微生物转化获得水解产物 ， 该化合物结构式 如图 -1 所示 。 北京大学郭洪祝等 [22~23]利用微生物发酵 制备原人参二醇衍生物和原人参三醇衍生物 ， 它们的 化学结构如图 -2 所示 ， 这类化合物通过体外抗肿瘤 活性测定发现具有较好的抗肿瘤活性 。
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人参研究
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2011 年第 2 期
Байду номын сангаас
低极性人参皂苷制备研究进展
刘发贵 张成中 郑毅男 ＊ （吉林农业大学中药材学院 长春 130118 ）
摘
要 ： 人参皂苷是人参 、 西洋参以及三七的主要活性成分之一 ， 研究表明人参皂苷 ， 尤其是低极性人参 皂苷具有很强的抗肿瘤作用 。 本文综述近几年低极性人参皂苷的制备以及结构修饰研究状况 ， 包括 ： 化学水解法 ， 酶水解法 ， 微生物发酵法 ， 加热加工法以及化学合成等研究方法 。
作者简介 : 刘发贵 ， 硕士研究生 ， 研究方向 : 生药学 . Email:dfzz2008@sohu.com
＊ 通讯作者 : 郑 毅 男 , 教 授 , 研 究 方 向 ： 天 然 产 物 化 学 研 究 及 新 药 开 发 .Email:zhenyinan@tom.
刘发贵等 ： 低极性人参皂苷制备研究进展 人参研究 GINSENG RESEARCH 2011 年第 2 期
变成 Rg3[2]。 稀硫酸水解三七根 、 叶及花总皂苷 ， 得到 6 种不同结构的皂苷元 ， 分别鉴定为 PD、PT、PD 含氧 庚环衍生物 、 达玛烷 -20(22)- 烯 -3β,12β,25- 三 醇 、20 (R)- 达玛烷-3β,12β,20,25- 四醇和 20(R)-PPT 。 同时证 明了其中有的皂苷元是由 PPD 或 PPT 衍生而 来 [3~4] 。 三七叶总皂苷经浓盐酸水解后得到 20(R)-PPD[5] 。 弱 酸水解 ： 如陈业高等人采用 50% 乙酸水溶液在 70℃ 水 浴 加 热 6h 水 解 三 七 叶 甙 制 备 人 参 皂 苷 Rh2 和 人 参皂苷 Rg3[6] 。 碱水解法 ： 强酸水解过于激烈 ， 易使苷 元发生脱 水 、 环合 、 双键位移等 ， 导致产物变化不易控制 ， 碱水 解法比酸水解法反应温和 ， 易于纯化 ， 特别适用 于遇 酸不稳定的皂苷水解 ， 宋长春等 [7] 以人参属植物的总 皂苷或原人参二醇组皂苷为原料 ， 转化 、 分离和提 取 了 20(S)-Rh2。 碱性条件下温和水解 ，PPT 组皂苷可得 到 Rh1 ，PPD 组皂苷可得到 Rh2。 特别是西洋参茎叶总 皂苷中人参皂苷 Rb3 含量较高 ， 碱水解后得到的人参 皂苷 Rh2 的收率也较高 [8]。 三七叶总皂苷以 2mol · L[9] 1NaOH 沸水加热水解后柱层析分得 PPD 。 上述利用 碱水解方法共有缺点是目标产物产率低 ， 现已较少使 用 ， 目前研究较多的是高沸点溶剂碱水解人参皂苷 ， 如李绪文等 [10]采用高沸点溶剂 235℃ 碱解西洋参总皂 苷 ， 产率为 5.01% 。 中国科学院大连化学物理研究所 杨凌等人 [11]采用惰性气体保护 、 游离基诱发剂为碱解 天然人参皂苷创造了良好条件 ， 从而显著降低了反应 温度 、 提高了反应的选择性 、 加快了反应速度 ， 解决了 定向制备低极性人参皂苷的问题 。 中山以诺生物科技