细胞毒T淋巴细胞识别的人类肿瘤抗原

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(收稿日期:2004202213 修回日期:2004205211)

作者单位:710032西安,第四军医大学西京医院检验科

细胞毒T 淋巴细胞识别的人类肿瘤抗原

顾克菊综述　于文彬审校

摘要　在多数肿瘤患者外周血淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞中,存在对自体肿瘤细胞有特异性杀伤作用的细胞毒T 淋巴细胞(CT L )。已鉴定出众多可被特异性CT L 所识别的抗原,一些抗原仅在肿瘤组织中表达,另一些是组织分化抗原或由广泛表达的基因点突变所产生。肿瘤抗原中部分人类白细胞抗原(H LA )2Ⅰ类分子限制性CT L 表位已被确定;临床应用已知抗原或抗原肽进行免疫治疗已取得一定疗效。

关键词　T 淋巴细胞,细胞毒性;抗原,肿瘤;肽类;免疫疗法

中图分类号　R730.3 文献标识码　A 文章编号　100028225(2004)0820575204

比利时学者Van der Bruggen 等[1]首次运用肿瘤特异的细胞毒T 淋巴细胞(cytotoxic T lym phocyte ,CT L )识别抗原技术鉴定黑色素瘤抗原,为肿瘤抗原研究开辟了新途径。其后利用此方法发现了许多黑色素瘤及其他肿瘤特异性抗原,并逐步确定了众多可与不同人类白细胞抗原(H LA )2Ⅰ类分子特异结合的抗原肽段。已有多种肿瘤抗原及抗原肽在临床试验中用于肿瘤免疫治疗,部分患者获得较好疗效[2]。

目前肿瘤抗原的鉴定有3种主要方法:①运用肿瘤特异的CT L 去筛选肿瘤细胞cDNA 表达文库,用基因克隆法鉴定编码抗原基因,进而分析CT L 识别的抗原肽段;②部分新的抗原肽类是从肿瘤细胞上用稀酸洗脱结合在H LA 2Ⅰ类分子上的肽段,可通过质谱仪分析法鉴定抗原;③运用内源性的抗体反应去筛选源于肿瘤的cDNA 表达文库,即血清学鉴定重组cDNA 表达抗原克隆(SEREX )技术。现综述近年来CT L 识别抗原及其在肿瘤免疫治疗中的研究进展。1　CT L 识别抗原机制

CT L 是C D8+T 淋巴细胞,可特异性杀伤靶细

胞,在机体细胞免疫中发挥重要作用,尤其抗病毒、抗细胞内细菌和抗肿瘤细胞作用更为突出。肿瘤细胞可以将内源性抗原在内质网内水解成9～11个氨

基酸的肽段,然后与主要组织相容性复合物(MHC )2Ⅰ类分子结合,呈现于细胞膜上。C D8+T 细胞通过T 细胞受体识别肿瘤细胞表面的MHC 2Ⅰ与抗原肽

复合物,从而发挥特异性裂解肿瘤细胞的作用。研究表明,MHC 2Ⅰ类分子也能够递呈外源性抗原从而诱导CT L 反应,具有吞噬功能的抗原递呈细胞(APC )在激活CT L 应答过程中发挥关键作用。树突状细胞(DC )可通过交叉呈递使外源性抗原进入MHC 2Ⅰ类分子途径,将外源性蛋白质抗原呈递给C D8+T 细胞,诱导机体产生抗原特异性CT L [3]。2　肿瘤抗原的鉴定2.1　肿瘤抗原鉴定技术

用患者肿瘤细胞刺激C D8+T 细胞,获得CT L 克隆,然后用转染了自体肿瘤细胞基因组或cDNA 表达文库的细胞重新刺激,对表达阳性细胞的cDNA 进行测序,确定编码相关抗原基因。利用此种方法可鉴定众多可被CT L 识别的肿瘤抗原[4,5],如基因

MAGE2A1、BAGE21、G AGE21。此后又发展了其他一些鉴定方法。遗传学的方法,如用探针筛选重组基因文库、对现有G enBank的筛选以及基于PCR的cDNA消减技术,从而发现了H AGE、S AGE和LAGE2 1基因;SEREX技术,该方法基于大部分肿瘤患者血清中含有抗肿瘤细胞表面或胞内蛋白抗体,用自体血清筛选肿瘤组织的重组cDNA表达文库,确定了SSX21、SCP21、LAGE22及NY2ES O21基因,得到大量编码肿瘤特异抗原的序列。

2.2　肿瘤抗原分类

2.2.1　肿瘤特异性共享抗原:这类肿瘤抗原由某类基因家族编码,已鉴定的有MAGE2A、MAGE2B、MAGE2C、BAGE、G AGE、S AGE、H AGE、SSX、SCP1、LAGE及NY2ES O21等10个基因家族,多数基因位于X染色体,编码多种抗原及抗原肽。

MAGE基因家族包含24个相关功能基因,分为3类即MAGE2A、MAGE2B和MAGE2C。这些基因在除睾丸和胎盘的所有正常组织中处于静止状态,但在许多人类肿瘤中却常有表达,包括黑色素瘤、肺癌、肉瘤、头颈部肿瘤和膀胱癌等,具有高度肿瘤特异性,在肾癌和白血病中极少表达。在这些肿瘤抗原研究过程中,与不同型别H LA2Ⅰ类分子结合的抗原肽段已逐步得到确定[6]。MAGE21基因表达与基因启动子去甲基化作用有关。另有一些针对乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌的CT L识别的粘蛋白上的表位。粘蛋白是一种表面蛋白质,包含有20个氨基酸的多次重复结构,在正常细胞中粘蛋白高度糖基化,而在肿瘤组织中糖基化的降低使肽重复结构暴露,导致CT L识别。这些粘蛋白具有严格肿瘤特异性,且无H LA限制性,因而可作为肿瘤免疫治疗的疫苗制备。

2.2.2　组织特异性分化抗原:已鉴定的黑色素瘤分化抗原有酪氨酸酶、Melan2A2Mart21、gp100、gp75、TRP21及TRP22,仅表达于黑色素瘤和黑色素细胞,多数抗原肽类为H LA2A2所呈递[7]。有日本学者近年来利用从一肺腺癌浸润T淋巴细胞建立的H LA2 A2404限制性CT L克隆细胞系,发现和鉴定了7个肺癌抗原,包括环孢菌素A受体B,腺癌抗原1、腺癌抗原4、多重耐药相关蛋白3、BT B结构域2、H BP 及尚未命名的clone83,其表达均有组织特异性[8,9]。

2.2.3　突变所致肿瘤特异抗原:由肿瘤组织中突变基因编码产生,已鉴定出cyclin2DK4、β2连环蛋白(β2 catenin)、F LICE、MUM21、H LA2A2等。cyclin2DK4的基因突变阻止了其抑制剂P16与C DK24结合,促使细胞进入细胞周期[10];参与Fas或T NF受体凋亡信号转导蛋白F LICE的基因突变,使细胞不发生凋亡;基因突变的β2catenin与转录因子LEF21形成活化复合物,异常激活基因转录。

2.2.4　过表达抗原:这类肿瘤抗原由肿瘤组织中过表达的基因编码,包括HER2/neu,PRAME。HER2/ neu在正常组织中表达低,而在30%的乳腺癌和卵巢癌中有高水平表达[11]。

2.2.5　病毒抗原:这类肿瘤抗原来源于致癌病毒,如人类乳头瘤病毒16(HPV16)的癌蛋白E7中的肽类,在多数宫颈癌中均可发现,这类抗原肽由H LA2 A2呈递至CT L。

目前研究仅有黑色素瘤等少数肿瘤被鉴定可为T细胞所识别的肿瘤抗原表位,绝大多数人类肿瘤特异性抗原未明,而且某种单一抗原决定簇无法引起有效抗瘤效应,必须针对多个抗原决定簇共同作用才能发挥最佳抗肿瘤效应。因此有必要筛选更多的肿瘤抗原或抗原肽,为肿瘤生物治疗奠定基础。对于多数实体瘤,由于免疫原性弱,难以产生H LA2Ⅰ类分子限制性肿瘤特异性CT L,其肿瘤抗原仍不明确。研究发现,其弱免疫原性是由于肿瘤细胞低表达或不表达H LA2Ⅰ类分子,不能有效呈递抗原给淋巴细胞而引起[12]。

3　CT L识别抗原肽的确定

利用肿瘤抗原特异性CT L识别技术已确定了部分H LA2Ⅰ类分子限制性抗原肽,但是多数肿瘤抗原基因编码的抗原肽段尚不明确。H LA2Ⅰ类分子限制性抗原肽的鉴定方法是先根据编码序列合成9～11个氨基酸的肽段,检测其体外刺激初始T细胞获得抗原特异性CT L的能力。由此确定了肽段MAGE2A11A1、BAGE211C w16和G AGE211C w6等。确定H LA2Ⅰ类分子限制性抗原肽,首先通过对MAGE2 3蛋白序列中相关氨基酸残基筛选,然后评价H LA 分子与这些肽的亲和力,合适的肽段用于刺激源自健康志愿者的血淋巴细胞,若获得具有溶细胞活性的T细胞,即建立CT L克隆并对负载抗原肽段的靶细胞进行杀伤实验,最后对表达MAGE23及相关H LA 分子的靶细胞进行杀伤实验,确定抗原也被肿瘤细胞提呈,由此鉴定出可被H LA2A2、B4402及B4403呈递的MAGE23肽段。近年来又发展了一种基于用抗原蛋白负载DC或将携带编码抗原基因的病毒转染DC刺激初始T淋巴细胞的方法,称为反向免疫学。其确定抗原肽的步骤为:①分离识别抗原肽的