藻类基因工程研究

7.医用蛋白的表达 • 利用鱼腥藻和聚球藻表达肿瘤坏死因子 基因、人表皮生长因子基因、人尿激素 酶原基因、人小肠三叶因子基因 • 利用盐藻和海带表达乙肝病毒表面抗原 基因
八、转基因藻的检测 • DNA水平：PCR、Southern杂交等。 • RNA水平：RT-PCR、Northern杂交、 荧光定量PCR等。 • 蛋白质水平：Western杂交等
• 水体占地球表面积的70%以上，水体中存在大 量的藻类，任何时候都保持在6.25×1025个； • 它们提供了大气中40-50%的氧，是水体中最 重要的初级生产力，将太阳能转化成化学能； • 藻类就如同陆地上的果蔬、草和森林，为水体 中的鱼、虾、蟹和贝类等各种水生生物提供食 物，处于食物链的最底层。 • 藻类是我们生存环境中非常重要的组成，研究 清楚和利用好藻类资源对人类的生存和发展非 常重要。
目的蛋白的检测
缺陷株修复：精氨酸缺陷株、硝酸还原酶缺陷株等 抗生素筛选：Zeomycin/潮霉素/壮观霉素等
Western杂交：BLE蛋白、绿色荧光蛋白等
蛋白质的功能：绿色荧光蛋白、抗菌肽等 代谢产物：虾青素、PHB等
• 玻璃珠搅拌法 :它的原理是小玻璃珠（石英砂） 和衣藻细胞共振荡，然后利用玻璃珠产生的瞬 间剪切力快速撕开衣藻的细胞膜，从而导入外 源基因。该法的特点：廉价，不需要特别的仪 器；转化频率不高；整合基因的拷贝数低；需 要去除细胞壁。
•
影响因素：电压，电流强 电穿孔法 度，电转化杯和缓冲液等 :它是利用脉冲电场改变细胞膜的状
1.核基因组转化
• 1989年，Karen.L Kindle等通过玻璃珠－外源DNA －衣藻共振荡技术，把硝酸盐还原酶基因导入去 壁的nitl－ 衣藻缺陷株中，恢复了该突变株的硝 酸盐还原酶活性，并通过共转化把精氨琥珀酰裂 合酶基因导入衣藻nit1突变株中。通过该法成功 导入的外源基因还有ble，aphⅤIII等。 • 2002年，Ladygin.Boutanaev等通过电激法把潮霉 素磷酸转移酶基因（hpt）导入细胞壁缺陷的莱茵 衣藻 。 • 比较合适的方法是玻璃珠搅拌法和电穿孔法。 • 特 点：一般是随机插入。
线状DNA整合示意图
双交换
单交换
外源基因
随机插入
环状DNA整合示意图
• 当某一单拷贝基因插入某一染色体中时, 其整合位置可能有如下几种: • (1)整合进染色体上基因的调控序列; • (2)整合到染色体上任一基因中, 处于内 含子中或内含子外。 • (3)无义序列 • 外源基因整合进细胞质时,其整合位置也 有2种,即: • (1)整合进叶绿体ＤＮＡ中; • (2)整合进线粒体ＤＮＡ中。
• 报告基因筛选 ：获得报告基因，导入藻 细胞，通过观察或生物化学方法检测产 物。例如： • 荧光素酶基因luxCt： • 绿色荧光蛋白基因：蓝光激发会产生绿 色荧光。 • GUS：
六、已建立遗传转化模型的藻类
• • • • • • • • • • 聚球藻：天然转化 集胞藻：天然转化 鱼腥藻：接合转化 衣藻：ble基因、hpt基因、aadA基因等 小环藻：NPTII基因 小球藻：荧光素酶基因、硝酸还原酶基因 螺旋藻：氯霉素乙酰转移酶基因（cat) 红藻： GUS基因表达 海带:-葡糖甘酸酶（GUS）基因表达 盐藻：氯霉素乙酰转移酶基因（cat)
态和通透性,形成可逆的瞬间通道，外源DNA 通过通道进入细胞。它的操作简单快速，转化 率较高，常用于细菌，植物和动物细胞的转化、 融合实验中。
• 激光微束穿孔法 :激光是一种很强的单色电 磁辐射,一定波长的激光束经聚焦后可引起 膜的可逆性穿孔。具体做法是:在荧光显微 镜下找出适当的细胞,然后用激光光源替代 荧光光源,聚焦后发出激光微束脉冲,击穿细 胞壁,使DNA分子进入细胞。由于激光孔径 小,为线粒体、叶绿体的遗传工程以及细胞 质遗传的研究提供了方便的手段。
蓝藻又称为蓝细菌，具有类似细菌的质粒DNA。
• 接合转化：利用广谱宿主接合质粒使 DNA通过细胞接触从一种细菌转移到另 一种细菌（通常是蓝藻），主要适用于 丝状蓝藻，如鱼腥藻； • 天然转化：蓝藻在指数生长期不经处理 直接吸收外源DNA （通常是蓝藻）。目 前主要适用于聚球藻和集胞藻。
五、遗传转化中常用的筛选标记
• 多聚物介导法 :PEG法是化合物PEG、多聚-Ｌ-鸟氨 酸(pLO)、磷酸钙及高pH值的条件下诱导原生质体摄 取外源DNA分子。这些多聚物和二价阳离子(如 Mg2+,Ca2+,Mn2+)及DNA常常在原生质体表面形成沉 淀颗粒,通过原生质体的内吞作用而进入细胞内部。
• 低能离子束法 :余增亮等在研究低能离子束与细胞 表面相互作用的过程中,发现离子束对细胞壁具有刻 蚀作用,提出离子束介导转基因的设想。十多年来, 离子束介导的遗传基因转化,在水稻、小麦、棉花、 烟草、西瓜等多种植物上取得成功。
二、藻类基因工程研究的历史
• 早在1850年就有人开始研究藻类的培养，有非常 悠久的历史； • 1970年就有证明DNA可以进入单细胞蓝藻-聚球藻。 后来的研究也表明此类原核微藻具有类似细菌的 质粒DNA; • 1982年实现了莱茵衣藻的遗传转化，现在它已成 为唯一可进行核、叶绿体和线粒体三套基因组遗 传转化的光合生物； • 在90年代，以海带为代表的大型海藻基因工程研 究得到了快速的发展.
1.杀蚊幼毒素 • 将芽孢杆菌内毒素基因转入聚球藻、集 胞藻，并在转基因藻中合成内毒素，可 用于杀死水体中的蚊子幼虫。 • 有中科院获得的转基因藻具有高效的杀 蚊毒效，并可长效表达，制成的干藻粉 可抑制蚊虫滋生可达2月之久，处于国际 领先水平。
2.油脂类
• 通过代谢基因工程改造产油藻，提高某些油脂 的含量，可通过提高关键酶的活性，或是抑制 相关代谢支路的反应，微藻合成的油脂可食用 或用于生产生物柴油； • 通过导入不饱和脂肪酸合成的关键酶，改造脂 肪酸合成途径，获得不饱和脂肪酸。 • 在鱼腥藻中导入脱饱和酶基因，通过转基因手 段将EPA合成酶基因导入聚球藻，将乙酰辅酶 A羧化酶基因acc1导入小环藻。
ACCase的作用机制
PEPC参与脂类合成的竞争示意图
生物柴油
3.合成生物可降解塑料-PHB
• PHB原产于细菌，将其合成的三个关 键酶基因，酮硫解酶、乙酰辅酶A还原 酶和PHB合成关键酶基因导入，利用 藻类光合作用产生的乙酰辅酶A廉价合 成PHB。 • 藻类不能利用PHB，有利于它的积累， 在聚球藻中导入三个关键酶基因，在 衣藻中的合成已获得成功。
2. 优势
• 它可作为生物活性基因和抗逆基因的来源； • 蓝藻、红藻中发现的质粒有可能改造成基因工程 的载体，用于外源基因的表达研究； • 衣藻、聚球藻等模式生物遗传背景清晰、基因工 程技术成熟，可以作为研究其他藻类的平台； • 由于密码子的偏好型和启动子的通用性，藻类有 可能成为植物基因表达的反应器； • 海洋生物中发现了大量具有价值的药物，可利用 微藻进行大规模的生产； • 多种经济藻类已具备相当的养殖规模，转基因藻 已具备产业化条件(螺旋藻、红球藻、小球藻、海 带、紫菜等).
三、遗传转化的的理论基础
转化
藻
1.外源基因的整合原理
• 外源基因一般通过同源片段的双交换,定 点整合到基因组中。在表达载体中引入同 源片段,当载体通过一定的方法被导入藻 细胞时,同源片段完全或几乎完全取代受 体基因组上的同源区域,外源基因也随之 插入到基因组的特定位点。 • 也可通过单交换整合进基因组中； • 还可以通过转座子随机整合进入基因组中。
RBCS2： 1，5－二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）
小ห้องสมุดไป่ตู้基编码基因
2.叶绿体基因组转化
• Boynton 等（1988）用包裹有野生型莱茵衣藻叶绿体 atpB基因的高速金属微粒轰击含有atpB 缺陷的突变株， 使之恢复了光合功能。 • Mayfield（2003）在衣藻叶绿体获得人类抗单纯疱疹 病毒糖蛋白D抗体大单链（HAV8-lsc）的活性表达产 物。 • 比较合适的方法是基因枪法。 • 特 点：一般是双交换，为定点插入。
1.定义
• 藻类基因工程：利用DNA重组技术，根据 研究目的将外源或内源基因通过一定的技 术手段整合到藻类的基因组中，获得藻类 新品种，或是表达特定的目的基因，它包 括目的基因的克隆、转移外源基因所需载 体的构建、外源基因的遗传转化技术和检 测方法的建立等。最终实现特定蛋白、疫 苗和次生代谢产物等有价值产品的生产， 它是一种现代的、崭新的、分子水平的生 物工程技术。
4.合成抗菌肽
• 将从鱼中分离出来的抗菌肽基因导入衣藻 中合成，开发成鱼类食物，可提高鱼的抗 病能力。提取出来也可以作为医用。
转基因衣藻总蛋白抑菌效果图
• 利用小球藻生产兔防御素，避免利用大 肠杆菌生产时产生的自我毒杀作用。转 基因藻生产的兔防御素经层析分离后得 到电泳级纯度，具有抑菌活性。
5. 污水、重金属污染物的处理
以衣藻的遗传转化研究为例
• 衣藻作为遗传转化系统的优势： • （1）结构简单； • （2）具有核基因组、叶绿体和线粒体三套 遗传转化系统，是唯一同时具备三套遗传 转化系统的光合生物； • （3）培养条件简单，生长周期短，光合效 率高； • （4）作为模式生物，遗传背景清晰，并已 完成全基因组测序。
藻类基因工程研究
王潮岗
•提纲
• • • • • • • • 藻类基因工程研究的意义 藻类基因工程研究的历史 遗传转化的的理论基础 常见的遗传转化方法 遗传转化中常用的筛选标记 已建立遗传转化模型的藻类 转基因藻的应用前景 转基因藻的检测
一、藻类基因工程研究的意义
• 你所知道的藻类？ • 我们肉眼可见的如：海带、紫菜、浒苔等。 肉眼不可见的更多，如：硅藻、衣藻、微 囊藻等。 • 淡水中分布的微囊藻、平裂藻、颤藻、小 球藻等；海水中分布的海带、紫菜、裙带 藻、龙须菜等；陆地上分布的发菜（念球 藻）。 • 种类繁多、分布广泛。
• 在鱼腥藻、聚胞藻、聚球藻和衣藻中表 达金属硫蛋白基因，可以大大提高转基 因藻对重金属吸附能力； • 导入高效利用N、P元素的基因，制成固 定化藻，大大提高转基因藻对水体中过 多的N、P元素的吸收，处理生活污水。
6.生长因子
• 利用聚球藻表达鲑鱼生长因子基因，并 开发成鱼类的食物，提高鱼类生长和产 量。
• 基因缺失互补筛选 ：获得缺陷株，导入具有正 常功能的基因，修复缺失基因，恢复功能。例 如：ARG7 （精氨酸酸裂解酶 ）；NIT1 （硝酸 盐还原酶 ）等。 • 基因修复：恢复功能。
缺失基因不能生长
修复基因，能生长
• 抗生素筛选 ：获得抗性基因，导入藻细 胞，使藻细胞具有抗生素抗性。例如： ble （具腐草霉素和Zeocin抗性 ）； aphVIII （巴龙霉素、卡那霉素和新霉 素 ）；addA （具有壮观霉素和链霉素抗 性）
四、常见的遗传转化方法
• 基因枪法 :它的基本原理是用外力（氦气）为包 含有外源DNA的金属微粒 (金粉或钨粉 )加速使 其获得极高的速度，然后轰击植物材料 ,金属颗 粒进入细胞的同时也把外源DNA导入植物细胞 里。该法的特点：简单，可重复性好；多拷贝克 隆；随机整合；需要昂贵的仪器；对宿主的选择 性不大。
3.线粒体转化
• 1993年，Barbara等人通过“基因枪”类似的 方法将莱茵衣藻的线粒体DNA导入莱茵衣藻 dum－1缺陷株中，修复该缺陷株。 • 莱茵衣藻dum－1缺陷株：删除了线粒体 DNA15.8kb中的1.5kb，影响了CYB基因，导 致它不能在黑暗中生长。 • 线粒体中有许多与呼吸相关的基因，可以为我 们解释等线粒体疾病。 • 线粒体转化一般是单交换，为定点插入。
小结
• 良好的转化系统必须同时具有4个特点:
• 1、DNA高效导入细胞
• 2、标记基因灵敏表达
• 3、转化细胞正常繁殖
• 4、外源基因稳定遗传 • 5 、完整的转化载体至少应包括启动子、筛选基因和 终止子
七、转基因藻的应用前景
• • • • • 具有活性的药用蛋白质 抗体、抗原的合成 污水处理及重金属吸附等 油脂生产 新型可食用藻类品种