苹果快繁

热处理+茎尖培养
❖ E、培养条件为：温度25℃，光照强度1 000～1 5001x，光照时间12～16h／d。
❖ F、当试管苗长至2～3cm时，转移到生根培 养基中诱导生根，根系发达后进行驯化移栽。
❖ 该方法可全部脱去苹果褪绿叶斑病毒和茎沟 病毒等潜隐病毒，比单用热处理脱毒效果好 得多。
3、茎尖微体嫁接培养
有6种。 ❖ 分为非潜隐性病毒和潜隐性病毒二大类，
其中潜隐性病毒类的带毒率高达40％～ 100％，且多为数种病毒复合侵染，导 致生长势减弱、产量下降等。
❖ 苹果感染的病毒主要有苹果褪绿叶斑病毒
(ACLSV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果茎沟
病毒(ASGV)和苹果凹茎病毒(ApSGV)等 。
（二）、苹果的脱毒
❖ 预处理结束后，转入37℃±1.5 ℃高温下处理，光 照强度3 000Lx，光照时间12h／d，由于热处理材 料密封在三角瓶内，故人工气候箱内不加湿。设3 个处理时间，分别为4周、5周和6周，每处理8瓶。
处理结果
❖ 温度37℃±1.5℃
❖
28d ，可脱去褪绿叶斑病毒 35d，可脱去茎沟病毒。
❖ 白天37℃±1.5℃ 在变温下，既可脱去褪绿叶斑 ❖ 晚上32℃±1.5℃ 病毒和茎沟病毒，
（三）、苹果病毒检测
❖ 1．木本指示植物法 该方法比较可靠，操作 简单，但需要时间较长，一般需要2～3年， 近年来应用温室鉴定可大大缩短时间，10周 内即可完成。
2．酶联免疫吸附法(ELISA)
❖ 把抗原与抗体的免疫反应和酶的高效催化作 用结合起来，形成一种酶标记的免疫复合物， 结合在该复合物上的酶，遇到相应的底物时， 催化无色的底物产生水解，形成有色的产物， 从而判断被检测材料是否有病毒。该方法具 有操作简便、快速的优点
苹果的脱毒与快繁
脱毒苗生产
❖ 自20世纪70年代以来，苹果茎尖培养技术日 趋成熟，在脱毒苗生产、矮化砧和无性系的 快速繁殖方面得到了广泛的应用。
❖ 20世纪80年代以后，植物细胞工程和基因工 程技术迅猛发展，为苹果品种改良和苗木繁Leabharlann Baidu育开辟了一条高效的新途径。
一、脱毒技术
❖ （一）、病毒种类 ❖ 苹果病毒病有20余种，目前我国查明的
D、培养
❖ 外植物体接种后，在弱光(300Lx)下培养10d 左右，然后将不带菌的茎尖或梢段转接到新 鲜培养基上，在黑暗条件下继续培养形成黄 化丛芽，如不经黑暗培养，直接在一般培养 室光照培养，亦能成功，形成绿色丛芽。
2、继代培养
❖ 苹果茎尖培养的增殖方式主要是丛生芽块的分割和 嫩茎扦插，
❖ 当丛生芽生长缓慢或生长停止时，将它切割成若干 小块，每块有2个～3个嫩茎，并清除基部多余的愈 伤组织，转接到继代培养基上，剪下的茎尖或茎段， 大于1cm时，扦插在培养基中。
❖ 每个100ml三角瓶，接种4～5块丛芽或5～7个茎段。 转接后7d～10d，侧芽和基部新分化的侧芽大量萌 发，形成新的丛生芽，140d左右，苗高于5cm，停 止生长又可分割，继而不断增加试管嫩茎的数量。
❖ D、接穗可从试管新梢培养得到，以液 体培养基湿润接穗，然后与砧木胚轴的 维管束部位连接，
❖ E、一周后接触部位产生愈伤组织，互 相就结合了。6周后接穗产生4片～6片 叶时，就可往外移栽。
❖ F、微体嫁接时，接穗以茎尖大小0.2～ 0.3mm，带有2～3个叶原基为宜；嫁接 成活率以5月份最高。这样既可以除去 病毒，又有较高的成活率。
❖ 目前采用的脱毒措施主要有热处理脱毒、茎 尖组织培养脱毒、热处理加茎尖组织培养脱 毒及苹果茎尖的微体嫁接培养脱毒等。
1、热处理脱毒
❖ 采用高温空气热处理法，处理短枝富士的方法为： 将苗高2cm～3cm，每个三角瓶内3～4株，转接到 分化培养基15d时，置于人工气候箱高温环境中处 理，为提高苹果嫩梢耐热性，先进行预处理。预处 理温度32℃±1.5℃，时间为1周。
❖ 变温能使存活率最高，从而获得最多的无潜隐病毒 组培苗。
2、热处理结合茎尖培养脱毒
❖ 将苹果休眠植株置于20～25℃温室内诱导芽 萌发，待长到5～6片叶时，置于脱毒室内。
❖ A、首先在32℃和35℃温度,分别预处理1周， ❖ B、然后在37℃±1.5℃、相对湿度80％，处
理28d，得到生长健壮的5～10cm长的新生嫩 枝。
C、剥取茎尖
❖ 在无菌操作条件下剥取茎尖，在解剖镜下， 用镊子、刀片等工具把芽外面的幼叶和叶原 基除去，使生长点暴露。用利刀切下带1～3 个叶原基，大小为0.1～0.3mm的生长点利于 脱毒培养。如用于快速繁殖时，茎尖一般取 0.5mm～2.0mm，容易成活与增殖。
❖ 然后接种于MS+BA0.5～1.5+NAA0.01～ 0.05+蔗糖30g／L～35g／L+琼脂5.5g／L～ 7g／L,pH为5.8的培养基上。
热处理+茎尖培养
❖ C、将新生嫩枝切成1cm左右的茎段，首先用 70％的酒精消毒30～60s，再用0.1％的氯化 汞消毒l0min，最后用含0.5％维生素C和0.3 ％柠檬酸的无菌溶液冲洗3次。
❖ D、在超净工作台上，于解剖镜下，切下刚 分化出的不定芽生长点，切取2mm茎尖接种 到MS+BA2.0mg／L+IBA0.4 mg／L培养基上 进行培养。
❖ A、以优良砧木如金冠、M7等种子作砧木。 ❖ B、种子经低温层积处理后，再消毒，去种皮
后将胚接种到含有MS无机盐和0.8％琼脂的 培养基，在25℃黑暗条件下培养15d，去掉 上胚轴和子叶。
❖ C、去顶幼苗移至液体培养基(含有MS无机盐 和7％蔗糖)的平底试管中，内有一滤纸桥， 中有小孔，砧木幼苗胚轴穿过小孔使其固定。
二、苹果的离体快繁技术
❖ 1、取材与消毒 ❖ A、取材 作为苹果试管繁殖的外植体材料，
主要用茎尖和茎段， ❖ 茎尖多在早春叶芽刚萌动或长出1cm～1.5cm
嫩茎时剥取。 ❖ 茎段用新梢端部,未木质化或半木质化的部分。
B、消毒
❖ 将早春萌动叶芽，取枝中段，流水冲洗2h， 剪成单芽茎段，剥去2个～4个鳞片，进行表 面消毒，常用0.1％～0.2％HgCl2+0.1％吐温20，消毒10min～15min，或2％次氯酸钠消 毒15min～20min。再用无菌水冲洗4次～5次，