第十章聚合酶链式反应技术专题讲解

PCR的原理
Denaturing
95˚C
Extension 72˚C
Annealing
Tm-5˚C
PCR的过程 （1）第一步 变性（denature） 94-95 oC下5分钟，模板DNA双链 完全变性成单链。 （2）第二步 复性（anneal）
50-60 oC下1分钟，引物与模板复性。
① 引物的浓度高， ② 引物的链短。
PCR体系组成
（1）Taq DNA聚合酶 自从H.A. Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合 酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断 （37 oC )，PCR技术才进入实用阶段。
① 热稳定性 Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高 温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。
第十章 聚合酶链式反应技术
Chapter 10 Technology of Polymerase Chain Reaction, (PCR)
内容
PCR的概念及技术的创建 PCR的基本原理及特点 PCR的反应体系和条件优化 PCR产物分析 PCR常用技术和应用
Kary B Mullis
(1944-)
② 最适温度高 最适温度： 72-78 oC 延伸速度： 约1000nt/min酶分子 最长延伸长度：6.7kb
③ Taq酶的功能与缺点
具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活 性，但没有3’ 5’外切酶活性。
合成超过600bp长度的DNA就有可能出现 错配，用于克隆基因时必须测序。
④ Taq DNA聚合酶的激活剂 金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。
denaturation、 annealing 、 extension （三阶段，多循环）
目的DNA（特异性） 拷贝数增加 2n倍
PCR技术的基本原理
属于无细胞的分子克隆，
在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA, 四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引 物,
通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个 循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一 般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。
理论计算：
419=2.751011。
即2.751011 bp的基因组中有一次 完全与19个核苷酸的序列相同的 机会（或机会是约2×10-11）。
一般引物设计为长15-30bp。
③引物的碱基序列
3’端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。
primer
3’GCTAGCTACTTAAG5’ 5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’
延伸72 ℃ 1min
35 cycles
变性 95 ℃
延伸 72 ℃
退火 Tm-5℃
PCR Principle
template denaturatation Primer annealing Primer extension
PCR反应的特点
• 特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性
• 灵敏度高 指数增长，从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6)水平
Forward primer vs Reverse primer Primer1 vs Primer2
⑤引物的Tm值
手工计算： Tm=（G+C)4 + (A+T)2
酶： 解旋酶，引物酶， DNA聚合酶， 连接酶
DNA polymerase
反应条件： 胞液环境，37 ℃
buffer，三种变化的温度（94，50-70， 72 ℃），cycles（25-35）
反应过程： 起始（模板DNA解链、形成引发体）、 延长、终止（三阶段）
产物：
模板DNA （基因组DNA） 拷贝数增加一倍ห้องสมุดไป่ตู้
当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.70.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是 2.0mmol/L。
50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性。
（2）引物（primer) ①位置 与待扩增的模板DNA区段的两3’端 序列互补（ 5‘端相同）的短DNA。
3’ 3’
②引物的长度
3）避免形成引物二聚体（dimer） 两个引物之间不能有两个以上的 连续碱基序列互补。 primer1
5’GGTCTGCCAGTCTAC3’
3’CAGGACTTAGTCACT5’ primer2
Sense primer vs Antisense primer Upstream primer vs Downstream primer
l 1983 年发明了PCR技术 l 1993年度获得诺贝尔化学奖
DNA的体内复制：
原料： template DNA（genomic DNA ）， RNA primer，dNTPs
PCR：
template DNA（genomic DNA ， cDNA）, a pair of specific oligonucleotide primer，dNTPs
（3）第三步 延伸（extend）
72 oC下1-2分钟，Taq DNA聚合酶 在引物的3‘端上加上核苷酸。
（4）第四步 变性（denature）
94 oC下1分钟，新合成的DNA双 链又变性成单链模板。 （5）第五步 重复（repeat）
PCR反应条件
变性 95 ℃ 5min
变性 95 ℃ 1min 退火 55 ℃ 1min 延伸 72 ℃ 1min
template
5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点 顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或 生物素标记等，方便与以后操作。
④引物的碱基组成 1）尽可能提高G+C含量，以提高引物
与模板的结合力 2）避免连续相同碱基排列或内部回文序列.
5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’
发卡结构 TGCTAGCCGCGA5’GTCTAC3’
• 简便、快速 2～4 小时完成扩增
• 对标本的纯度要求低
不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或 包埋的组织切片也可以直接用于作模板。
PCR仪
PCR反应
标准的PCR反应体系
10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加双或三蒸水至
10ul 各200umol/L 10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L 100ul