赖氨酸脱羧酶发酵工艺及酶学性质
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2 结果与讨论
2. 1 发酵培养基组成对酶活的影响 2. 1. 1 不同碳源对酶活的影响
以牛肉膏蛋白胨培养基为基础 ,添加 ρ(L 2赖氨 酸 ) = 5 g /L 为诱导物和 ρ(碳源 ) = 20 g /L ,考察不 同碳源对菌体酶活力的影响 。以牛肉膏蛋白胨培养 基培养的菌体相对比酶活定义为 100%。
(1)斜面培养基 ( g /L ) :蛋白胨 10,牛肉浸膏 5, 氯化钠 5,玉米浆 5,琼脂 18; pH = 712。
(2)牛肉膏蛋白胨培养基 ( g /L ) :蛋白胨 10,牛 肉浸膏 3,氯化钠 5。 1. 2 方法 1. 2. 1 菌种斜面培养
将菌株接入种子培养基斜面培养 14 h。 1. 2. 2 菌种液体培养
Abstract:L 2Lysine can be converted to cadaverine w ith lysine decarboxylase which is found in Hafn ia a lvei AS 111009. Factors affecting the enzymatic activity were studied. The op timum fermentation medium consists ofρ( saccharose) = 20 g /L ,ρ( corn steep liquor) = 20 g /L ,ρ( yeast extract) = 5 g /L , ρ( beef extract) = 3 g /L ,ρ(pep tone) = 10 g /L ,ρ(NaC l) = 5 g /L ,ρ〔(NH4 ) 2 SO4 〕= 2 g /L ,ρ( vitam in B6 ) = 5 g /L andρ(L 2lysine) = 5 g /L. 5 mL liquid bacteria was inoculated in 100 mL zymotic fluid. The op timal fermentation conditions are temperature 35 ℃, initial pH of the bHale Waihona Puke Baiduffer 510,ρ( bacterium ) = 10 g /L andρ( Tween - 80) = 0115 g /L. Enzymatic activity can rise to 7 984. 43 U and conversion of
第 23卷第 11期 2 0 0 6年 1 1月
生物工程
精细化工
F INE CHEM ICAL S
赖氨酸脱羧酶发酵工艺及酶学性质3
Vol. 23, No. 11 Nov. 2 0 0 6
蒋丽丽 ,吴晓燕 ,刘 毅 ,刘 茜 , 焦庆才
(南京大学 生命科学学院 医药生物技术国家重点实验室 ,江苏 南京 210093)
OC
OH
该反应的 L 2赖氨酸脱羧酶是诱导性胞内酶 ,需 要磷酸吡哆醛 ( pyridoxal phosphate) 作为辅酶促进 脱羧反应 [ 5 ] 。
本文考察了不同条件下蜂房哈夫尼菌菌体细胞 中 L 2赖氨酸脱羧酶的活力 ,确定了利用蜂房哈夫尼 菌制备尸胺的最佳工艺条件 。本方法具有原料价格 低廉 、步骤简单 、生产周期短 、产物不需分离 、无污 染 、产率高的特点 ,具有较好应用前景 。
THZ - C 恒 温 振 荡 器 (太 仓 博 莱 特 实 验 仪 器 厂 ) ,W ZZ - 2B 自动旋光仪 (上海西光实业有限责任 公司 ) ,日立 CR22E型离心机 (日本 H itachi公司 ) , V313捷达图像分析系统 (江苏省捷达软件工程有限 公司 ) 。 1. 1. 4 培养基
= 10 g /L 的发酵液中 ,菌体存活率非常低 。表明高 质量浓度的维生素 B6 对菌体的生长起到了抑制作 用 ,从而减少了酶的产量 ,最终影响底物的转化 。
图 2 不同氮源对酶活的影响 Fig. 2 Effect of nitrogen source on enzymatic activity
3 收稿日期 : 2006 - 05 - 01;定用日期 : 2006 - 07 - 15 基金项目 :国家技术创新基金 (02CJ - 13 - 01 - 16) 作者简介 : 蒋丽丽 ( 1979 - ) , 女 , 南京 , 硕士研究生 , 师从焦庆才教授 , 从事生物制药和手性药物生物转化研究 , 电话 /传真 : 025 83594376, E - mail: fineny0926@ sina. com。
发酵培养基灭菌 ,无菌条件下接种 ,于 35 ℃, 170 r/m in振荡培养 14 h。离心收集菌体 ,用缓冲液
洗涤 ,继续转化 。 1. 2. 3 菌体酶活测定
在 250 mL 三角烧瓶中加入湿菌体 1 g、L 2赖氨 酸 1 g, 012 mol/L 乙酸缓冲液 (pH = 5) 100 mL 和吐 温 280 0115 g,于 35 ℃, 170 r/m in振荡反应 1 h。取 1μL 转化液做纸层析 ,层析后显色烘干 ,尸胺显色 斑点在 L 2赖氨酸斑点之上 ,利用凝胶成像系统对层 析结果进行扫描 ,测定不同浓度 L 2赖氨酸斑点光密 度的变化 。其光密度值与 L 2赖氨酸溶液浓度之间 的回归方程为 :
氮源的添加对酶活增加效果比较显著 ,尤其是 两种铵盐 。兼顾成本与效果 ,以添加 ρ(硫酸铵 ) = 2 g /L的培养基成分为最佳 。 2. 1. 3 酵母膏和玉米浆对酶活的影响
以牛肉膏蛋白胨培养基为基础 ,添加 ρ(L 2赖氨 酸 ) = 5 g /L诱导物 、ρ(蔗糖 ) = 20 g /L、ρ(硫酸铵 )
y = 1043. 2x + 53. 06 R2 = 019742
式中 : x为光密度值 , y为 L 2赖氨酸浓度 (μmol/ L ) 。由标准曲线可查得反应液中 L 2赖氨酸浓度 。
比酶活定义为在 35 ℃, pH = 510, 1 h内 ,由 1 g 湿菌体所转化消耗的 L 2赖氨酸的 μmol数 ,单位为 U , 1 U = 110μmol·g- 1 ·h- 1 。
以牛肉膏蛋白胨培养基为基础 ,添加 ρ(L 2赖氨 酸 ) = 5 g /L 诱导物 、ρ(蔗糖 ) = 20 g /L 和分析纯的 不同质量浓度的氯化铵 、硫酸铵 、尿素 ,考察其对 L 2 赖氨酸脱羧酶的影响 ,不加无机氮源培养的菌体相 对比酶活定义为 100% ,结果见图 2。
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精 细 化 工 F INE CHEM ICA L S 第 23卷
Ferm en ta tion and Properties of L ysine D ecarboxyla se
J IANG L i2li,WU Xiao2yan, L IU Yi, L IU Q ian, J IAO Q ing2cai
( The S ta te Key L abora tory of Pha rm aceu tic B iotechnology, S chool of L ife S cience, N an jing U n iversity, N an jing 210093, J iangsu, Ch ina)
enzymatic activity
第 11期
蒋丽丽 ,等 :赖氨酸脱羧酶发酵工艺及酶学性质
·1061·
L 2赖氨酸脱羧酶 ( EC 4. 1. 1. 18 )是生物体内高
度专一性酶 ,催化 L 2lys脱羧生成尸胺 (1, 52戊二胺 )
和二氧化碳 ,反应式如下 :
NH2
H2N
CH _ CH2 β 4 NH2
H2 C _ CH2 β 4 NH2 + CO2
摘要 :考察了蜂房哈夫尼菌 ( H. a lvei AS1. 1009)的 L 2赖氨酸脱羧酶对 L 2赖氨酸的脱羧作用 ,分析了培养基 、温 度 、pH、激活剂等因素对酶活力的影响 。实验结果表明 ,最适培养基成分为 :ρ(蔗糖 ) = 20 g/L、ρ(玉米浆 ) = 20 g /L、ρ(酵母膏 ) = 5 g/L、ρ(牛肉膏 ) = 3 g/L、ρ(蛋白胨 ) = 10 g /L、ρ(氯化钠 ) = 5 g /L、ρ(硫酸铵 ) = 2 g/L、ρ(维生 素 B6 ) = 5 g /L和 ρ(L 2赖氨酸 ) = 5 g/L , 100 mL发酵液中接种量为 5 mL液体菌种 。最佳转化工艺条件为 :转化 体系温度 35 ℃、pH = 510,ρ(菌体 ) = 10 g /L ,ρ(吐温 280) = 0115 g /L。L 2赖氨酸脱羧酶在最适发酵和转化条件下 比酶活可达 7 984. 43 U ,底物转化率可达 70%。 关键词 :蜂房哈夫尼菌 AS 1. 1009; L 2赖氨酸脱羧酶 ; L 2赖氨酸 ;尸胺 ;发酵工艺 中图分类号 : TQ426. 97 文献标识码 : A 文章编号 : 1003 - 5214 (2006) 11 - 1060 - 05
尸胺 (1, 52戊二胺 )是一种多胺 ,有刺激性气味 。 它是生物体内广泛存在的具有生理活性的含氮碱 , 在腐烂的尸体和精液中都可分离得到 。尸胺可以作 为第二信使调控植物衰老进程 、促进雌雄蕊的发育 , 外源施用尸胺可以改善坐果和促进果实发育 [ 1～3 ] , 在增加果实产量和研究植物生长中有重要利用价 值。
the substrate reaches 70%.
Key words: Hafn ia a lvei AS1. 1009; L 2lysine decarboxylase; L 2lysine; cadaverine; ferm entation
Founda tion item : Supported by the technology innovation foundation of China (02CJ - 13 - 01 - 16)
= 2 g /L ,再分别加入不同浓度的玉米浆和酵母膏 。 以不加这两种物质培养的菌体相对比酶活定义为
100% ,分别考察玉米浆和酵母膏对酶活的影响 ,结 果见表 1。
表 1 酵母膏和玉米浆对酶活的影响 Table 1 Effect of corn steep liquor and yeast extract on
1 材料和方法
1. 1 材料 1. 1. 1 菌种
蜂房哈夫尼菌 (Hafn ia a lvei) AS 1. 1009,北京微 生物研究所提供 。 1. 1. 2 药品与试剂
L 2赖氨酸 ,磷酸二氢钠 ,磷酸氢二钠 ,氯化钠 ,氢 氧化钠 ,磷酸二氢钾 ,硫酸镁 ,硫酸铵 ,尿素 ,氯化铵 , 葡萄糖 ,蔗糖 ,可溶性淀粉 ,冰乙酸 ,乙酸钠 ,酵母膏 , 蛋白胨 ,牛肉膏 ,玉米浆 ,琼脂 ,茚三酮 ,维生素 B6 , 吐温 280,十六烷三甲基溴化铵 (CTAB ) ,聚乙二醇辛 基苯基醚 (OP) 。所用试剂均为市售生化试剂 或 AR。 1. 1. 3 仪器
文献 报道 Takahashi等 [ 4 ] 以 D , L 2赖氨 酸 为 底
物 ,通过大肠杆菌 L 2赖氨酸脱羧酶不对称降解 L 2赖 氨酸得 D 2赖氨酸和尸胺 。该反应主要为进行 D 2赖 氨酸制备工艺的开发 ,尸胺的分离过程复杂 ,成本 高 ,产率低 。
本文采用 L 2赖氨酸 (L 2Lys)酶法工艺 ,利用蜂 房哈夫尼菌 (Hafn ia a lvei) AS1. 1009L - 赖氨酸脱羧 酶专一性脱羧作用 ,直接通过一步反应将 L 2赖氨酸 脱羧转化生成尸胺 。
图 1 不同碳源对酶活的影响 Fig. 1 Effect of carbon source on enzymatic activity
由图 1可知 ,不同碳源对 L 2lys脱羧酶酶活影响 很大 ,其中蔗糖的影响最大 。由于蔗糖为二糖 ,是迟 效碳源 ,在酶大量产生的对数生长期后期能有效地 保证菌体生长 。 2. 1. 2 不同氮源对酶活的影响
2. 1 发酵培养基组成对酶活的影响 2. 1. 1 不同碳源对酶活的影响
以牛肉膏蛋白胨培养基为基础 ,添加 ρ(L 2赖氨 酸 ) = 5 g /L 为诱导物和 ρ(碳源 ) = 20 g /L ,考察不 同碳源对菌体酶活力的影响 。以牛肉膏蛋白胨培养 基培养的菌体相对比酶活定义为 100%。
(1)斜面培养基 ( g /L ) :蛋白胨 10,牛肉浸膏 5, 氯化钠 5,玉米浆 5,琼脂 18; pH = 712。
(2)牛肉膏蛋白胨培养基 ( g /L ) :蛋白胨 10,牛 肉浸膏 3,氯化钠 5。 1. 2 方法 1. 2. 1 菌种斜面培养
将菌株接入种子培养基斜面培养 14 h。 1. 2. 2 菌种液体培养
Abstract:L 2Lysine can be converted to cadaverine w ith lysine decarboxylase which is found in Hafn ia a lvei AS 111009. Factors affecting the enzymatic activity were studied. The op timum fermentation medium consists ofρ( saccharose) = 20 g /L ,ρ( corn steep liquor) = 20 g /L ,ρ( yeast extract) = 5 g /L , ρ( beef extract) = 3 g /L ,ρ(pep tone) = 10 g /L ,ρ(NaC l) = 5 g /L ,ρ〔(NH4 ) 2 SO4 〕= 2 g /L ,ρ( vitam in B6 ) = 5 g /L andρ(L 2lysine) = 5 g /L. 5 mL liquid bacteria was inoculated in 100 mL zymotic fluid. The op timal fermentation conditions are temperature 35 ℃, initial pH of the bHale Waihona Puke Baiduffer 510,ρ( bacterium ) = 10 g /L andρ( Tween - 80) = 0115 g /L. Enzymatic activity can rise to 7 984. 43 U and conversion of
第 23卷第 11期 2 0 0 6年 1 1月
生物工程
精细化工
F INE CHEM ICAL S
赖氨酸脱羧酶发酵工艺及酶学性质3
Vol. 23, No. 11 Nov. 2 0 0 6
蒋丽丽 ,吴晓燕 ,刘 毅 ,刘 茜 , 焦庆才
(南京大学 生命科学学院 医药生物技术国家重点实验室 ,江苏 南京 210093)
OC
OH
该反应的 L 2赖氨酸脱羧酶是诱导性胞内酶 ,需 要磷酸吡哆醛 ( pyridoxal phosphate) 作为辅酶促进 脱羧反应 [ 5 ] 。
本文考察了不同条件下蜂房哈夫尼菌菌体细胞 中 L 2赖氨酸脱羧酶的活力 ,确定了利用蜂房哈夫尼 菌制备尸胺的最佳工艺条件 。本方法具有原料价格 低廉 、步骤简单 、生产周期短 、产物不需分离 、无污 染 、产率高的特点 ,具有较好应用前景 。
THZ - C 恒 温 振 荡 器 (太 仓 博 莱 特 实 验 仪 器 厂 ) ,W ZZ - 2B 自动旋光仪 (上海西光实业有限责任 公司 ) ,日立 CR22E型离心机 (日本 H itachi公司 ) , V313捷达图像分析系统 (江苏省捷达软件工程有限 公司 ) 。 1. 1. 4 培养基
= 10 g /L 的发酵液中 ,菌体存活率非常低 。表明高 质量浓度的维生素 B6 对菌体的生长起到了抑制作 用 ,从而减少了酶的产量 ,最终影响底物的转化 。
图 2 不同氮源对酶活的影响 Fig. 2 Effect of nitrogen source on enzymatic activity
3 收稿日期 : 2006 - 05 - 01;定用日期 : 2006 - 07 - 15 基金项目 :国家技术创新基金 (02CJ - 13 - 01 - 16) 作者简介 : 蒋丽丽 ( 1979 - ) , 女 , 南京 , 硕士研究生 , 师从焦庆才教授 , 从事生物制药和手性药物生物转化研究 , 电话 /传真 : 025 83594376, E - mail: fineny0926@ sina. com。
发酵培养基灭菌 ,无菌条件下接种 ,于 35 ℃, 170 r/m in振荡培养 14 h。离心收集菌体 ,用缓冲液
洗涤 ,继续转化 。 1. 2. 3 菌体酶活测定
在 250 mL 三角烧瓶中加入湿菌体 1 g、L 2赖氨 酸 1 g, 012 mol/L 乙酸缓冲液 (pH = 5) 100 mL 和吐 温 280 0115 g,于 35 ℃, 170 r/m in振荡反应 1 h。取 1μL 转化液做纸层析 ,层析后显色烘干 ,尸胺显色 斑点在 L 2赖氨酸斑点之上 ,利用凝胶成像系统对层 析结果进行扫描 ,测定不同浓度 L 2赖氨酸斑点光密 度的变化 。其光密度值与 L 2赖氨酸溶液浓度之间 的回归方程为 :
氮源的添加对酶活增加效果比较显著 ,尤其是 两种铵盐 。兼顾成本与效果 ,以添加 ρ(硫酸铵 ) = 2 g /L的培养基成分为最佳 。 2. 1. 3 酵母膏和玉米浆对酶活的影响
以牛肉膏蛋白胨培养基为基础 ,添加 ρ(L 2赖氨 酸 ) = 5 g /L诱导物 、ρ(蔗糖 ) = 20 g /L、ρ(硫酸铵 )
y = 1043. 2x + 53. 06 R2 = 019742
式中 : x为光密度值 , y为 L 2赖氨酸浓度 (μmol/ L ) 。由标准曲线可查得反应液中 L 2赖氨酸浓度 。
比酶活定义为在 35 ℃, pH = 510, 1 h内 ,由 1 g 湿菌体所转化消耗的 L 2赖氨酸的 μmol数 ,单位为 U , 1 U = 110μmol·g- 1 ·h- 1 。
以牛肉膏蛋白胨培养基为基础 ,添加 ρ(L 2赖氨 酸 ) = 5 g /L 诱导物 、ρ(蔗糖 ) = 20 g /L 和分析纯的 不同质量浓度的氯化铵 、硫酸铵 、尿素 ,考察其对 L 2 赖氨酸脱羧酶的影响 ,不加无机氮源培养的菌体相 对比酶活定义为 100% ,结果见图 2。
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精 细 化 工 F INE CHEM ICA L S 第 23卷
Ferm en ta tion and Properties of L ysine D ecarboxyla se
J IANG L i2li,WU Xiao2yan, L IU Yi, L IU Q ian, J IAO Q ing2cai
( The S ta te Key L abora tory of Pha rm aceu tic B iotechnology, S chool of L ife S cience, N an jing U n iversity, N an jing 210093, J iangsu, Ch ina)
enzymatic activity
第 11期
蒋丽丽 ,等 :赖氨酸脱羧酶发酵工艺及酶学性质
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L 2赖氨酸脱羧酶 ( EC 4. 1. 1. 18 )是生物体内高
度专一性酶 ,催化 L 2lys脱羧生成尸胺 (1, 52戊二胺 )
和二氧化碳 ,反应式如下 :
NH2
H2N
CH _ CH2 β 4 NH2
H2 C _ CH2 β 4 NH2 + CO2
摘要 :考察了蜂房哈夫尼菌 ( H. a lvei AS1. 1009)的 L 2赖氨酸脱羧酶对 L 2赖氨酸的脱羧作用 ,分析了培养基 、温 度 、pH、激活剂等因素对酶活力的影响 。实验结果表明 ,最适培养基成分为 :ρ(蔗糖 ) = 20 g/L、ρ(玉米浆 ) = 20 g /L、ρ(酵母膏 ) = 5 g/L、ρ(牛肉膏 ) = 3 g/L、ρ(蛋白胨 ) = 10 g /L、ρ(氯化钠 ) = 5 g /L、ρ(硫酸铵 ) = 2 g/L、ρ(维生 素 B6 ) = 5 g /L和 ρ(L 2赖氨酸 ) = 5 g/L , 100 mL发酵液中接种量为 5 mL液体菌种 。最佳转化工艺条件为 :转化 体系温度 35 ℃、pH = 510,ρ(菌体 ) = 10 g /L ,ρ(吐温 280) = 0115 g /L。L 2赖氨酸脱羧酶在最适发酵和转化条件下 比酶活可达 7 984. 43 U ,底物转化率可达 70%。 关键词 :蜂房哈夫尼菌 AS 1. 1009; L 2赖氨酸脱羧酶 ; L 2赖氨酸 ;尸胺 ;发酵工艺 中图分类号 : TQ426. 97 文献标识码 : A 文章编号 : 1003 - 5214 (2006) 11 - 1060 - 05
尸胺 (1, 52戊二胺 )是一种多胺 ,有刺激性气味 。 它是生物体内广泛存在的具有生理活性的含氮碱 , 在腐烂的尸体和精液中都可分离得到 。尸胺可以作 为第二信使调控植物衰老进程 、促进雌雄蕊的发育 , 外源施用尸胺可以改善坐果和促进果实发育 [ 1～3 ] , 在增加果实产量和研究植物生长中有重要利用价 值。
the substrate reaches 70%.
Key words: Hafn ia a lvei AS1. 1009; L 2lysine decarboxylase; L 2lysine; cadaverine; ferm entation
Founda tion item : Supported by the technology innovation foundation of China (02CJ - 13 - 01 - 16)
= 2 g /L ,再分别加入不同浓度的玉米浆和酵母膏 。 以不加这两种物质培养的菌体相对比酶活定义为
100% ,分别考察玉米浆和酵母膏对酶活的影响 ,结 果见表 1。
表 1 酵母膏和玉米浆对酶活的影响 Table 1 Effect of corn steep liquor and yeast extract on
1 材料和方法
1. 1 材料 1. 1. 1 菌种
蜂房哈夫尼菌 (Hafn ia a lvei) AS 1. 1009,北京微 生物研究所提供 。 1. 1. 2 药品与试剂
L 2赖氨酸 ,磷酸二氢钠 ,磷酸氢二钠 ,氯化钠 ,氢 氧化钠 ,磷酸二氢钾 ,硫酸镁 ,硫酸铵 ,尿素 ,氯化铵 , 葡萄糖 ,蔗糖 ,可溶性淀粉 ,冰乙酸 ,乙酸钠 ,酵母膏 , 蛋白胨 ,牛肉膏 ,玉米浆 ,琼脂 ,茚三酮 ,维生素 B6 , 吐温 280,十六烷三甲基溴化铵 (CTAB ) ,聚乙二醇辛 基苯基醚 (OP) 。所用试剂均为市售生化试剂 或 AR。 1. 1. 3 仪器
文献 报道 Takahashi等 [ 4 ] 以 D , L 2赖氨 酸 为 底
物 ,通过大肠杆菌 L 2赖氨酸脱羧酶不对称降解 L 2赖 氨酸得 D 2赖氨酸和尸胺 。该反应主要为进行 D 2赖 氨酸制备工艺的开发 ,尸胺的分离过程复杂 ,成本 高 ,产率低 。
本文采用 L 2赖氨酸 (L 2Lys)酶法工艺 ,利用蜂 房哈夫尼菌 (Hafn ia a lvei) AS1. 1009L - 赖氨酸脱羧 酶专一性脱羧作用 ,直接通过一步反应将 L 2赖氨酸 脱羧转化生成尸胺 。
图 1 不同碳源对酶活的影响 Fig. 1 Effect of carbon source on enzymatic activity
由图 1可知 ,不同碳源对 L 2lys脱羧酶酶活影响 很大 ,其中蔗糖的影响最大 。由于蔗糖为二糖 ,是迟 效碳源 ,在酶大量产生的对数生长期后期能有效地 保证菌体生长 。 2. 1. 2 不同氮源对酶活的影响