A型产气荚膜梭菌的分离及鉴定
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第二份菌液加 １％胰酶液，３７℃活化 ３０ｍｉｎ，之后 按上述方法重复一次。
根据产气荚膜梭菌毒素与定型血清中和试验结 果判定表 （表 ２），判定分离到的产气荚膜梭菌的菌 型。
表 １ 产气荚膜梭菌毒素中和试验加样表 （ ｍｌ）
ห้องสมุดไป่ตู้
１
２
３
４
５
Ｂ
０．２
－
－
－
－
Ｃ
－
０．２
－
－
－
产气荚膜梭菌分型血清
Ｄ
－
－
０．２
－
－
Ｅ
－
－
－ ０．２
－
－
生理盐水
－
－
－
－
０．２
菌液上清液
０．６
０．６
０．６
０．６
０．６
总量
０．８
０．８
０．８
０．８
０．８
表 ２ 产气荚膜梭菌毒素中和试验结果判定表
注射后小白鼠反应
Ｂ 型抗毒素＋样品滤液
＋
＋
＋
－
＋
Ｃ 型抗毒素＋样品滤液
＋
＋
－
－
＋
Ｄ 型抗毒素＋样品滤液
－
＋
－
－
＋
Ｅ 型抗毒素＋样品滤液
－
－
－
鉴定项目 结果
动力 －
石蕊牛乳 暴烈发酵
表 ３ 分离菌株的生理生化特性
明胶液化 ＋
吲哚 －
硝酸盐还原 ＋
硫化氢 ＋
卵磷脂酶 ＋
葡萄糖 ⊕
蔗糖 ⊕
注： “⊕”表示产酸产气； “＋”表示阳性； “－ ”表示阴性
麦芽糖 ⊕
乳糖 ⊕
甘露醇 －
水杨苷 －
棉子糖 ⊕
２．４ 血清型鉴定结果 结果显示，３９ 株中有 ２８ 株 Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ 型产气荚膜
Ｐ１：５＇－ ＣＧＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＡ－ ３＇，Ｐ２： ５＇－ ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡ－ ３＇，在上游引物 中引入 ＮｃｏＩ 酶切位点，下游引物中引入 ＸｈｏＩ 酶切位 点，由宝生物大连有限公司合成。模板经 ９４℃变性 １ｍｉｎ， ４５℃退火 ３０ｓ，７２℃延伸 １ｍｉｎ，经 ３５ 个循环后 琼脂糖凝胶电泳检测。ＰＣＲ 产物克隆到载体 ｐＥＴ２８ａ（＋） 中进行序列测定（宝生物大连有限公司），应用 ＤＮＡ－
菌体中央或近端，与 Ａ 型产气荚膜梭菌标准菌株形态 相符（见图 １，２）。 ２．２ 菌落形态和培养特性
将疑似菌落接种于血平板后，可见到血平板上培 养出的菌落周围呈双溶血环，内环为完全溶血、外环为
图 １ Ａ 型产气荚膜杆菌标准菌株菌体形态 （革兰氏染色， １７５０×油镜）
图 ２ Ｊ５ 株产气荚膜杆菌菌体形态 （革兰氏染色， １７５０×油镜）
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ３９ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｃｅｒｖｕｓ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｉｎ Ｓｈａｎｘｉ ｐｒｏｖｉｎｃｅ， ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｌｙ， ｔｈｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｒｕｍ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｉｔ ｉｓ ｔｙｐｅ Ａ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ， ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｗｅｒｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｓｏ ｔｈｅ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｗａｓ ｍａｄｅ ｔｈａｔ ｔｙｐｅ Ａ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｉｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｔｈａｔ ｃａｕｓｉｎｇ ｃｅｒｖｕｓ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｉｎ Ｓｈａｎｘｉ ｐｒｏｖｉｎｃｅ， ａｎｄ ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｐｒｏｖｉｄｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： Ｓｈａｎｘｉ ｃｅｒｖｕｓ ｆａｒｍ， ｔｙｐｅ Ａ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
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Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｖｏｌ．２３ Ｎｏ． ７ ２００７ Ｊｕｌｙ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｓｂ．ｏｒｇ．ｃｎ
畜牧兽医科学
Ａ 型产气荚膜梭菌的分离及鉴定
高文伟 １， 郭宏伟 １， 任家琰 １， 蒋玉文 ２， 杨茂荣 ３， 赵玉臣 ３， 柴奎强 ３， 周县利 ３ （１ 山西农业大学动物科技学院，太谷 ０３０８０１；２ 中国兽药监察所，北京 １０００８１； ３ 山西省药物培植场，降县 ０４３６００）
产气荚膜梭菌是 １９９２ 年以来引起鹿“猝死症”的 主要病原菌之一，与俞乃盛［１２］和孙立明［１３］等报道的该 病由 Ｃ 型和 Ｄ 型产气荚膜梭菌引起不同，本试验从大 量病死鹿中分离到的产气荚膜梭菌，经血清型鉴定主 要是 Ａ 型，所以山西鹿“猝死症”主要由 Ａ 型产气荚膜 梭菌所引起，这为该病的防治和多价地方疫苗研制提 供了依据。
畜牧兽医科学
中国农学通报 第 ２３ 卷 第 ７ 期 ２００７ 年 ７ 月 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｓｂ．ｏｒｇ．ｃｎ
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１．１．２ 病料 共采集病料 ３９ 例。分别采自山西省阳泉 市北庄鹿场，燕龛鹿场，昔阳县大寨鹿场等发生出血性 肠炎的病死鹿。在鹿死亡 ２４ｈ 内采集病死鹿的肝、脾、 肾、肠系膜淋巴结、病变小肠及其内容物或发病期间的 血便。同时调查死亡鹿的发病史，临床症状，观察死后 鹿各脏器的病变情况。在病料采集过程中要尽可能避 免污染，将采集的病料置于冰壶，迅速送实验室检测 或－ ２０℃低温保存。 １．１．３ 产气荚膜梭菌分型血清 产气荚膜梭菌 Ｂ、Ｃ、 Ｄ、Ｅ 分 型 血 清 ， 购 自 中 国 兽 药 监 察 所 （ 批 号 ： ２００５０３１２１４５）。 １．１．４ 标准菌株 购自中国兽药监察所，菌株编号：Ａ 型产气荚膜杆菌 ＡＴＣＣ１３１２４。 １．２ 试验方法 １．２．１ 细菌的分离纯化 ①显微镜检查：取病死鹿的 肝脏和空肠、回肠、盲肠、结肠等内容物或粘膜抹片，革 兰氏染色后，在显微镜下观察。②细菌溶血性检查：分 别取产气荚膜梭菌疑似菌落接种于血平板，３７℃培养 １８～２４ｈ，观察血平板上是否有产气荚膜梭菌特有的 α、 β双溶血环。③细菌的纯化：分别从血平板上挑取有清
＋
＋
结果判定
Ｃ型
Ｄ型
Ｂ型
Ｅ型
Ａ型
注： “＋”表示小白鼠存活； “－ ”表示小白鼠死亡。
１．２．３ α毒 素 基 因 的 ＰＣＲ 检 测 与 核 苷 酸 序 列 分 析 将所分离到的产气荚膜梭菌（Ｊ５）以及 Ａ 型、Ｂ 型产气 荚膜梭菌标准菌株分别接种到肉肝胃酶消化汤中 ３７℃培养 ７～８ｈ，４℃，５０００ｒｐｍ 离心收集菌体，洗涤后 提取 ＤＮＡ，将其溶于 ＴＥ 缓冲液中，４℃保存备用。根据 α 毒素基因序列文献（Ｇｅｎｂａｎｄ），应用 Ｐｒｉｍｅｒ５．０ 软件 设计引物：
目前，中国鹿养殖量逐渐增加，主要集中在东北 和华北地区，山西鹿的存栏量位居全国前列，而且不 断呈上升态势。但随着养鹿业的大规模发展，全国各 地养鹿场出现了一种以膘情较好的青年公鹿多发的 发病急、死亡快、病死率高、以肠道出血为主要特征的 疾病，给养鹿业造成很大的损失［１～４］。通过流行病学调 查证明，在中国饲养的鹿中出血性肠炎发病率居首 位，是对中国养鹿业威胁较大的传染病之一［５，６］。对于本 病的治疗，理论上讲可以用一些抗生素及磺胺类药物 等进行对症治疗，但由于患畜发病一般都比较急，所 以多来不及治疗已死亡，而病势较缓的，即使用这些
晰双溶血环的产气荚膜梭菌典型菌落，接种于血斜面， ３７℃恒温培养箱中厌氧培养 ２４ｈ，取出后置 ２５℃有氧 环境 １ｈ，染色、镜检，并观察血斜面上的菌落特性。同 时接种厌氧肉肝胃酶消化汤，３７℃厌氧培养 １８ｈ，革兰 氏染色、镜检。④生化试验：将已纯化的细菌培养物接 种于各种生化培养基中，包括糖发酵试验（葡萄糖、蔗 糖 、麦 芽 糖 、水 杨 苷 、甘 露 醇 、棉 子 糖 等），吲 哚 试 验 ， Ｈ２Ｓ 试验，硝酸盐还原试验，明胶液化试验，卵磷脂试 验，石蕊牛乳发酵试验等，３７℃厌氧培养 ２４ｈ，通过其 生长表现判定细菌种属。 １．２．２ 血清型鉴定 取分离纯化的典型菌落，接种培 养，离心，然后取上清夜，分 ２ 份；第一份菌液按（表 １） 分别加样入 ５ 支灭菌小试管中，同时置 ３７℃恒温箱中 作用 ４０ｍｉｎ，之后将每管混合液注射小白鼠，２ 只／管， ０．４ｍｌ／只，７２ｈ 判定结果。
药物治疗，效果也很不理想［７～９］，因此对于该病的防治， 免疫预防尤为重要。而根据病原菌致病机理和免疫学 特性，选用当地分离的菌种制成鹿源灭活苗免疫，能 更确实可靠的预防本病流行。所以该试验对山西某些 鹿场发生鹿出血性肠炎急性病死鹿的病料进行采集， 通过对病原体进行鉴定，为后期研制多价的地方苗奠 定基础。 １ 材料与方法 １．１ 试验材料 １．１．１ 试 验 动 物 普通级昆明系小白鼠，体重 １６～ １８ｇ，购自山西医科大学试验动物中心。
梭菌抗血清均可中和其毒素，小白鼠健活，而对照组小 白鼠 １２ｈ 内全部死亡，加胰酶之后，结果和加胰酶前相 同，故可判定该菌血清型为 Ａ 型。可见，从 ３９ 例鹿出 血性肠炎病料中分离到 ２８ 株 Ａ 型产气荚膜梭菌，占 ８７．２％，故 Ａ 型产气荚膜梭菌是病料采集地鹿出血性 肠炎的主要致病菌。 ２．５ ＰＣＲ 检测结果
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畜牧兽医科学
ＳＩＳ 软件进行序列分析。 ２ 结果 ２．１ 革兰氏染色镜检
肠道取样中均可检测到呈阳性，两端钝圆、短杆 状、有荚膜、单个或成双排列的大杆菌，偶见芽孢，位于
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒ ａｃｔｅｒ ｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ａ Ｃｌｏｓｔｒ ｉｄｉｕｍ Ｐｅｒ ｆｒ ｉｎｇｅｎｓ Ｇａｏ Ｗｅｎｗｅｉ１， Ｇｕｏ Ｈｏｎｇｗｅｉ１， Ｒｅｎ Ｊｉａｙａｎ１， Ｊｉａｎｇ Ｙｕｗｅｎ２，Ｙａｎｇ Ｍａｏｒｏｎｇ３，
Ｚｈａｏ Ｙｕｃｈｅｎ３， Ｃａｉ Ｋｕｉｑｉａｎｇ３， ＺｈｏｕＸｉａｎｌｉ３
摘 要： 从山西各鹿场采集鹿出血性肠炎急性病死鹿病料 ３９ 例， 通过病原微生物分离培养， 形态学观 察和血清型鉴定， 初步表明分离到的产气荚膜梭菌主要是 Ａ 型， 对 ＰＣＲ 产物的序列分析表明经过 ＰＣＲ 得到了特异性的 α 毒素基因片段， 因而 Ａ 型产气荚膜梭菌是引起山西鹿场发生鹿出血性肠炎 的主要致病菌。为该疾病的防治和疫苗研制提供依据。 关键词： 山西鹿场； Ａ 型产气荚膜梭菌； 分离； 鉴定 中图分类号： Ｓ８５２．６ 文献标识码： Ａ
不完全溶血。置 ２５℃有氧环境下放置 １ｈ 后，菌落变为 灰绿色或草绿色。在厌气肉肝汤中，可见管内有大量气 体产生，液面充满白色泡沫。
通过以上试验可初步判定分离到的细菌为产气荚 膜梭菌。
２．３ 生化试验 试验测定了纯化细菌的 １４ 项生化指标，结果见表
３。分离到的菌株的生理生化特性基本一致，根据《伯杰 氏细菌鉴定手册》（第八版） 关于产气荚膜梭菌的生化 图谱，可确认这些分离株均为产气荚膜梭菌。
经过 ３５ 个循环的 ＰＣＲ 扩增，以 Ａ 型标准菌株作 为阳性对照，Ｂ 型标准菌株作为阴性对照，从分离株 Ｊ５ 中获得了与标准菌株片段大小一致的产物 （见图 ３）。 ２．６ 序列分析结果
测序结果（见图 ４）与国外报道 的 ［１０～１１］ 核苷酸序列
一致，进一步证实了上述 ＰＣＲ 产物为 Ａ 型菌所特有的 α毒素基因。 ３ 讨论
基金项目： 山西省攻关项目“鹿出血性肠炎多价疫苗的研制”（０１２０２９）。 第一作者简介： 高文伟，女，１９７０ 年出生，山西翼城县人，讲师，硕士，主要从事家畜寄生虫的教学和研究工作。通信地址：０３０８０１ 山西省太谷县山西农 业大学动物科技学院，Ｔｅｌ：０３５４－６２８８５２７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｘｎｄｇａｏｗｅｎｗｅｉ＠１６３．ｃｏｍ。 通讯作者简介： 任家琰，硕士生导师，教授，主要从事兽医微生物及免疫学的教学和研究工作。 收稿日期： ２００７－ ０３－ ２２，修回日期：２００７－ ０４－ １８。
（１Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ， Ｓｈａｎｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｔａｉｇｕ ０３０８０１；２Ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ Ａｃａｄｅｎｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１； ３Ｓｈａｎｘｉ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ Ｆｉｅｌｄ， Ｊｉａｎｇｘｉａｎ ０４３６００）
根据产气荚膜梭菌毒素与定型血清中和试验结 果判定表 （表 ２），判定分离到的产气荚膜梭菌的菌 型。
表 １ 产气荚膜梭菌毒素中和试验加样表 （ ｍｌ）
ห้องสมุดไป่ตู้
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产气荚膜梭菌分型血清
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生理盐水
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菌液上清液
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总量
０．８
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表 ２ 产气荚膜梭菌毒素中和试验结果判定表
注射后小白鼠反应
Ｂ 型抗毒素＋样品滤液
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Ｄ 型抗毒素＋样品滤液
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Ｅ 型抗毒素＋样品滤液
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鉴定项目 结果
动力 －
石蕊牛乳 暴烈发酵
表 ３ 分离菌株的生理生化特性
明胶液化 ＋
吲哚 －
硝酸盐还原 ＋
硫化氢 ＋
卵磷脂酶 ＋
葡萄糖 ⊕
蔗糖 ⊕
注： “⊕”表示产酸产气； “＋”表示阳性； “－ ”表示阴性
麦芽糖 ⊕
乳糖 ⊕
甘露醇 －
水杨苷 －
棉子糖 ⊕
２．４ 血清型鉴定结果 结果显示，３９ 株中有 ２８ 株 Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ 型产气荚膜
Ｐ１：５＇－ ＣＧＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＡ－ ３＇，Ｐ２： ５＇－ ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡ－ ３＇，在上游引物 中引入 ＮｃｏＩ 酶切位点，下游引物中引入 ＸｈｏＩ 酶切位 点，由宝生物大连有限公司合成。模板经 ９４℃变性 １ｍｉｎ， ４５℃退火 ３０ｓ，７２℃延伸 １ｍｉｎ，经 ３５ 个循环后 琼脂糖凝胶电泳检测。ＰＣＲ 产物克隆到载体 ｐＥＴ２８ａ（＋） 中进行序列测定（宝生物大连有限公司），应用 ＤＮＡ－
菌体中央或近端，与 Ａ 型产气荚膜梭菌标准菌株形态 相符（见图 １，２）。 ２．２ 菌落形态和培养特性
将疑似菌落接种于血平板后，可见到血平板上培 养出的菌落周围呈双溶血环，内环为完全溶血、外环为
图 １ Ａ 型产气荚膜杆菌标准菌株菌体形态 （革兰氏染色， １７５０×油镜）
图 ２ Ｊ５ 株产气荚膜杆菌菌体形态 （革兰氏染色， １７５０×油镜）
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ３９ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｃｅｒｖｕｓ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｉｎ Ｓｈａｎｘｉ ｐｒｏｖｉｎｃｅ， ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｌｙ， ｔｈｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｒｕｍ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｉｔ ｉｓ ｔｙｐｅ Ａ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ， ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｗｅｒｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｓｏ ｔｈｅ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｗａｓ ｍａｄｅ ｔｈａｔ ｔｙｐｅ Ａ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｉｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｔｈａｔ ｃａｕｓｉｎｇ ｃｅｒｖｕｓ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｉｎ Ｓｈａｎｘｉ ｐｒｏｖｉｎｃｅ， ａｎｄ ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｐｒｏｖｉｄｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： Ｓｈａｎｘｉ ｃｅｒｖｕｓ ｆａｒｍ， ｔｙｐｅ Ａ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
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Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｖｏｌ．２３ Ｎｏ． ７ ２００７ Ｊｕｌｙ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｓｂ．ｏｒｇ．ｃｎ
畜牧兽医科学
Ａ 型产气荚膜梭菌的分离及鉴定
高文伟 １， 郭宏伟 １， 任家琰 １， 蒋玉文 ２， 杨茂荣 ３， 赵玉臣 ３， 柴奎强 ３， 周县利 ３ （１ 山西农业大学动物科技学院，太谷 ０３０８０１；２ 中国兽药监察所，北京 １０００８１； ３ 山西省药物培植场，降县 ０４３６００）
产气荚膜梭菌是 １９９２ 年以来引起鹿“猝死症”的 主要病原菌之一，与俞乃盛［１２］和孙立明［１３］等报道的该 病由 Ｃ 型和 Ｄ 型产气荚膜梭菌引起不同，本试验从大 量病死鹿中分离到的产气荚膜梭菌，经血清型鉴定主 要是 Ａ 型，所以山西鹿“猝死症”主要由 Ａ 型产气荚膜 梭菌所引起，这为该病的防治和多价地方疫苗研制提 供了依据。
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中国农学通报 第 ２３ 卷 第 ７ 期 ２００７ 年 ７ 月 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｓｂ．ｏｒｇ．ｃｎ
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１．１．２ 病料 共采集病料 ３９ 例。分别采自山西省阳泉 市北庄鹿场，燕龛鹿场，昔阳县大寨鹿场等发生出血性 肠炎的病死鹿。在鹿死亡 ２４ｈ 内采集病死鹿的肝、脾、 肾、肠系膜淋巴结、病变小肠及其内容物或发病期间的 血便。同时调查死亡鹿的发病史，临床症状，观察死后 鹿各脏器的病变情况。在病料采集过程中要尽可能避 免污染，将采集的病料置于冰壶，迅速送实验室检测 或－ ２０℃低温保存。 １．１．３ 产气荚膜梭菌分型血清 产气荚膜梭菌 Ｂ、Ｃ、 Ｄ、Ｅ 分 型 血 清 ， 购 自 中 国 兽 药 监 察 所 （ 批 号 ： ２００５０３１２１４５）。 １．１．４ 标准菌株 购自中国兽药监察所，菌株编号：Ａ 型产气荚膜杆菌 ＡＴＣＣ１３１２４。 １．２ 试验方法 １．２．１ 细菌的分离纯化 ①显微镜检查：取病死鹿的 肝脏和空肠、回肠、盲肠、结肠等内容物或粘膜抹片，革 兰氏染色后，在显微镜下观察。②细菌溶血性检查：分 别取产气荚膜梭菌疑似菌落接种于血平板，３７℃培养 １８～２４ｈ，观察血平板上是否有产气荚膜梭菌特有的 α、 β双溶血环。③细菌的纯化：分别从血平板上挑取有清
＋
＋
结果判定
Ｃ型
Ｄ型
Ｂ型
Ｅ型
Ａ型
注： “＋”表示小白鼠存活； “－ ”表示小白鼠死亡。
１．２．３ α毒 素 基 因 的 ＰＣＲ 检 测 与 核 苷 酸 序 列 分 析 将所分离到的产气荚膜梭菌（Ｊ５）以及 Ａ 型、Ｂ 型产气 荚膜梭菌标准菌株分别接种到肉肝胃酶消化汤中 ３７℃培养 ７～８ｈ，４℃，５０００ｒｐｍ 离心收集菌体，洗涤后 提取 ＤＮＡ，将其溶于 ＴＥ 缓冲液中，４℃保存备用。根据 α 毒素基因序列文献（Ｇｅｎｂａｎｄ），应用 Ｐｒｉｍｅｒ５．０ 软件 设计引物：
目前，中国鹿养殖量逐渐增加，主要集中在东北 和华北地区，山西鹿的存栏量位居全国前列，而且不 断呈上升态势。但随着养鹿业的大规模发展，全国各 地养鹿场出现了一种以膘情较好的青年公鹿多发的 发病急、死亡快、病死率高、以肠道出血为主要特征的 疾病，给养鹿业造成很大的损失［１～４］。通过流行病学调 查证明，在中国饲养的鹿中出血性肠炎发病率居首 位，是对中国养鹿业威胁较大的传染病之一［５，６］。对于本 病的治疗，理论上讲可以用一些抗生素及磺胺类药物 等进行对症治疗，但由于患畜发病一般都比较急，所 以多来不及治疗已死亡，而病势较缓的，即使用这些
晰双溶血环的产气荚膜梭菌典型菌落，接种于血斜面， ３７℃恒温培养箱中厌氧培养 ２４ｈ，取出后置 ２５℃有氧 环境 １ｈ，染色、镜检，并观察血斜面上的菌落特性。同 时接种厌氧肉肝胃酶消化汤，３７℃厌氧培养 １８ｈ，革兰 氏染色、镜检。④生化试验：将已纯化的细菌培养物接 种于各种生化培养基中，包括糖发酵试验（葡萄糖、蔗 糖 、麦 芽 糖 、水 杨 苷 、甘 露 醇 、棉 子 糖 等），吲 哚 试 验 ， Ｈ２Ｓ 试验，硝酸盐还原试验，明胶液化试验，卵磷脂试 验，石蕊牛乳发酵试验等，３７℃厌氧培养 ２４ｈ，通过其 生长表现判定细菌种属。 １．２．２ 血清型鉴定 取分离纯化的典型菌落，接种培 养，离心，然后取上清夜，分 ２ 份；第一份菌液按（表 １） 分别加样入 ５ 支灭菌小试管中，同时置 ３７℃恒温箱中 作用 ４０ｍｉｎ，之后将每管混合液注射小白鼠，２ 只／管， ０．４ｍｌ／只，７２ｈ 判定结果。
药物治疗，效果也很不理想［７～９］，因此对于该病的防治， 免疫预防尤为重要。而根据病原菌致病机理和免疫学 特性，选用当地分离的菌种制成鹿源灭活苗免疫，能 更确实可靠的预防本病流行。所以该试验对山西某些 鹿场发生鹿出血性肠炎急性病死鹿的病料进行采集， 通过对病原体进行鉴定，为后期研制多价的地方苗奠 定基础。 １ 材料与方法 １．１ 试验材料 １．１．１ 试 验 动 物 普通级昆明系小白鼠，体重 １６～ １８ｇ，购自山西医科大学试验动物中心。
梭菌抗血清均可中和其毒素，小白鼠健活，而对照组小 白鼠 １２ｈ 内全部死亡，加胰酶之后，结果和加胰酶前相 同，故可判定该菌血清型为 Ａ 型。可见，从 ３９ 例鹿出 血性肠炎病料中分离到 ２８ 株 Ａ 型产气荚膜梭菌，占 ８７．２％，故 Ａ 型产气荚膜梭菌是病料采集地鹿出血性 肠炎的主要致病菌。 ２．５ ＰＣＲ 检测结果
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Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｖｏｌ．２３ Ｎｏ． ７ ２００７ Ｊｕｌｙ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｓｂ．ｏｒｇ．ｃｎ
畜牧兽医科学
ＳＩＳ 软件进行序列分析。 ２ 结果 ２．１ 革兰氏染色镜检
肠道取样中均可检测到呈阳性，两端钝圆、短杆 状、有荚膜、单个或成双排列的大杆菌，偶见芽孢，位于
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒ ａｃｔｅｒ ｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ａ Ｃｌｏｓｔｒ ｉｄｉｕｍ Ｐｅｒ ｆｒ ｉｎｇｅｎｓ Ｇａｏ Ｗｅｎｗｅｉ１， Ｇｕｏ Ｈｏｎｇｗｅｉ１， Ｒｅｎ Ｊｉａｙａｎ１， Ｊｉａｎｇ Ｙｕｗｅｎ２，Ｙａｎｇ Ｍａｏｒｏｎｇ３，
Ｚｈａｏ Ｙｕｃｈｅｎ３， Ｃａｉ Ｋｕｉｑｉａｎｇ３， ＺｈｏｕＸｉａｎｌｉ３
摘 要： 从山西各鹿场采集鹿出血性肠炎急性病死鹿病料 ３９ 例， 通过病原微生物分离培养， 形态学观 察和血清型鉴定， 初步表明分离到的产气荚膜梭菌主要是 Ａ 型， 对 ＰＣＲ 产物的序列分析表明经过 ＰＣＲ 得到了特异性的 α 毒素基因片段， 因而 Ａ 型产气荚膜梭菌是引起山西鹿场发生鹿出血性肠炎 的主要致病菌。为该疾病的防治和疫苗研制提供依据。 关键词： 山西鹿场； Ａ 型产气荚膜梭菌； 分离； 鉴定 中图分类号： Ｓ８５２．６ 文献标识码： Ａ
不完全溶血。置 ２５℃有氧环境下放置 １ｈ 后，菌落变为 灰绿色或草绿色。在厌气肉肝汤中，可见管内有大量气 体产生，液面充满白色泡沫。
通过以上试验可初步判定分离到的细菌为产气荚 膜梭菌。
２．３ 生化试验 试验测定了纯化细菌的 １４ 项生化指标，结果见表
３。分离到的菌株的生理生化特性基本一致，根据《伯杰 氏细菌鉴定手册》（第八版） 关于产气荚膜梭菌的生化 图谱，可确认这些分离株均为产气荚膜梭菌。
经过 ３５ 个循环的 ＰＣＲ 扩增，以 Ａ 型标准菌株作 为阳性对照，Ｂ 型标准菌株作为阴性对照，从分离株 Ｊ５ 中获得了与标准菌株片段大小一致的产物 （见图 ３）。 ２．６ 序列分析结果
测序结果（见图 ４）与国外报道 的 ［１０～１１］ 核苷酸序列
一致，进一步证实了上述 ＰＣＲ 产物为 Ａ 型菌所特有的 α毒素基因。 ３ 讨论
基金项目： 山西省攻关项目“鹿出血性肠炎多价疫苗的研制”（０１２０２９）。 第一作者简介： 高文伟，女，１９７０ 年出生，山西翼城县人，讲师，硕士，主要从事家畜寄生虫的教学和研究工作。通信地址：０３０８０１ 山西省太谷县山西农 业大学动物科技学院，Ｔｅｌ：０３５４－６２８８５２７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｘｎｄｇａｏｗｅｎｗｅｉ＠１６３．ｃｏｍ。 通讯作者简介： 任家琰，硕士生导师，教授，主要从事兽医微生物及免疫学的教学和研究工作。 收稿日期： ２００７－ ０３－ ２２，修回日期：２００７－ ０４－ １８。
（１Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ， Ｓｈａｎｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｔａｉｇｕ ０３０８０１；２Ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ Ａｃａｄｅｎｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１； ３Ｓｈａｎｘｉ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ Ｆｉｅｌｄ， Ｊｉａｎｇｘｉａｎ ０４３６００）