固定化酶概述
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
载体再生 费用
底物专一性
吸附法
结合法
物理吸附 .共价键结合 离子键结合
易 弱 较高 可能 低 不变
难 强 低 不可能 高 可变
易 中等 高 可能 低 不变
适用性
酶源多
较广
广泛
交联法
包埋法
较难 强
中等 不可能
中等 可变
较难 强 高
不可能 低
不变
较广
小分子底物、 药用酶
2． 选择方法依据： • （1） 酶的性质 • （2） 载体的性质 • （3） 制备方法的选择
固定化酶（细胞）对pH稳定性变化
固定化酶pH的变化
• 1） 载体带负电荷，最适pH向碱性方向移动。
3．固定化酶pH的变化
• 载体带正电荷，pH向酸性方向移动。
• （2）产物性质对pH的影响 • 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的操
作pH值比游离酶的pH值高；反之则低
4． 最适温度变化
• 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
• 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需 要的时间（t1/2）
3.评价固定化酶的指标：
• 3.
• 4.
或称偶联效率，活力保留百分数。 • 5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力
与游离酶活力的比值称为相对酶活力
第三节 固定化酶的制备 • 一． 一般方法及特点 • 二． 酶的固定化方法
A．重氮法例
• 5′-磷酸二酯酶的固定化。此酶用来降解核酸，可分离得到 四个5′-单核苷酸（本成果荣获国家发明三等奖，中国科学 院上海生化研究所袁中一等，我国第一个用于工业生产的 固定化酶）
B 叠氮法
•例
• 用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白 酶，步骤如下：
• ⑴ 酯化：CM-纤维素先洗涤干燥，然后悬于无 水甲醇中，在冰浴中通入HCl气体，进行酯化 反应；然后洗涤，空气干燥。
• 1．网格型 • 2．微囊型
1．网格型
• (1) 概念 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一 定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋 法
1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固 定化研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步 。
1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用 于DL-AA的光学分析，实现了酶连续反应的工业化 。这是世界上固定化酶用于工业的开端。
1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化 大肠杆菌细胞，成功实现了L-天冬氨酸连续生产。
A．重氮法
• ⑶ 去除多余的苯胺基(用0.5 M NaOH洗三次，水洗至无色） • ⑷ 重氮化盐制备。用5% NaNO2及1MHCl在10℃以下反应
15min，然后用预先冷却的0.05M HCl及H2O洗涤抽干即 成。 • ⑸ 偶联，先在酶液中加入硫酸铵（1：0.007）,然后调pH 值6.5，加入经重氮化的ABSE-纤维素，再调PH 值7.0， 在冰浴中反应两小时，过滤，洗涤抽干即为固定化酶，
细胞
非生长
生长
悬浮 固定化
酶液
固定化
材料
膜固定
连续
再循环系统
凝胶 吸附 化学连接物
半连续 分批
凝胶 吸附
生物催化剂
可溶
连续
吸附
包埋
间歇
间歇
酶 固定化
交联
化学连续 间歇
连续 活塞模式
搅拌连续反应器
连续 活塞模式 搅拌连续反应器
生物催化剂作用方式示意
1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了 酶 固定化研究，并第一次实现了酶的固定化。
戊二醛交联法
OHC(CH2)3CHO 戊二醛
H2N-E
-HC=N-E-N=CH（CH2）3-CH=N- E-
N
N
CH
CH
（三）交联法常用试剂
• 常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、双重氮联苯胺等。
• 应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质 的游离氨基形成席夫碱(shiff)
• 甲苯-2-异氰-4-异硫氰
• 常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体
❖ 载体上与酶偶联的基团：芳香氨基、羟基、羧基和羧甲基
（3）.共价偶联法中的几个影响因素
• （ 1 ）载体的物化性质要求载体亲水，并且有一定的机械强 度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团。
• （ 2 ）偶联反应的反应条件必须在温和pH、中等离子强度 和低温的缓冲溶液中。
固定化方法与载体的选择
1.必须注意维持酶的催化活性和专一性 2.酶与载体结合牢固 3.载体的机械强度 4.固定化酶要有最小的空间位阻 5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应 6.固定化酶要廉价
3． 固定化后酶的考察项目：
• （1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回 收率。
• （2） 考察固定化酶稳定性 • （ 3） 考察固定化酶最适反应条件
摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。 ——计量单位
1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/min =6*106IU
• 2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所 具有的酶活力单位 ——品质的体现
3.评价固定化酶的指标：
• 1. 固定化酶的比活：
每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位 面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。
• （1）酶蛋白N末端的α-氨基或赖氨酸残基的 ε-氨基。
• （2）酶蛋白C末端的α-羧基、天门冬氨酸残 基的β-羧基以及谷氨酸残基的γ-羧基。
• （3）苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。
酶蛋白上可供载体结合的功能基团
• （4）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪
氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲 哚基。
第二节 固定化酶的性质及其影响因素
• 一． 影响固定化酶性质的因素 • 二． 固定化后酶性质的变化 • 三． 评价固定化酶的指标
1.影响固定化酶性质的因素
1.酶本身的变化：主要是由于活性中心的氨基酸残 基、高级结构和电荷状态等发生了变化。
2.固定化方法的影响
1.影响固定化酶性质的因素 3．载体的影响
• 固定化酶
酶工业化应用着重解决的问题？
一 是改善其稳定性 可以实施连续操作 二 是要开发出一种经济的非破坏性的回收酶的方法
固定化
一 什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术
水不溶性酶（固定化酶）
•固定化酶:
•固定在载体上，并在一定范围内进行催化反应的酶。
第一节 概述 二 固定化酶的发展史
1） 分配效应 2） 空间障碍效应 3） 扩散限制效应
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液 称为宏观环境。
二．固定化后酶性质的变化-酶活性的影响
活力变化的原因：
1、酶分子在固定化过程中，空间构像可能发生了变化有时 活性中心的氨基酸也会参加反应。
2、固定化后的空间障碍效应的影响。 3、内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻 4、包埋法时高分子物质进入半透膜较困难
（三）交联法的形式
• 交联法有2种形式：
•
酶直接交联法
•
酶辅助蛋白交联
• 双重固定法
（1） 吸附交联法（壳状固定化酶）
• （2） 交联包埋法
（四） 包埋法（entrapping method）
• 定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使 酶固定化的方法称为包埋法。
（四） 包埋法
试剂（乙醇）稳定 性变化
固定化酶（细胞）对酶抑制剂（尿素）的稳 定性变化
2 ．固定化后酶稳定性提高的原因：
• a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 • b. 酶活力的释放是缓慢的。 • c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。
3． pH的变化-影响酶活的机理
• （1） 改变酶的空间构象 • （2）影响酶的催化基团的解离 • （3）影响酶的结合基团的解离 • （4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合 或结合后不能生成产物。
一． 一般方法及特点
关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研 究、改进。
1． 四大类方法： • 吸附法（包括电吸附法） • 结合法（无机多孔材料） • 交联法（双功能试剂） • 包埋法（微胶囊法）
• 吸附法 • 包埋法 • 共价结合法 • 交联法
各类固定化方法的特点比较:
比较项目
制备难易 固定化程度 活力回收率
2.固定化后酶性质的变化
• 结论-固定化对酶活性的影响：
1）酶活性下降 2）反应速度下降
二． 固定化酶的性质-对酶稳定性的影响
（1） 操作稳定性提高 （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 • (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 • (4 ) 对分解酶的稳定性提高。 • （5） 对变性剂的耐受力升高
• 5． 底物特异性变化
• 作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化
• 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。
固定化米氏方程推导
• 对简单的固定化酶系统，其动力学性质一般服从米氏方 程： 由于分配效应：ρ=[Si]微环境/[S]宏观环境
6． 米氏常数Km的变化，Km值 随载体性质变化
（一）结合法
• 1 离子键结合法 • 2 共价键结合法☆
2、共价结合（偶联）法
共价结合（偶联）法是目前研究中最为活跃的方法。它 的原理是酶蛋白分子上的功能基团和固相支持物表面上 的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在支持物上
（借助共价键将酶的非活性必需侧链基团和载体的功能 基团进行偶连）。
酶蛋白上可供载体结合的功能基团
• ⑵ 肼解。把酯化后的CM-纤维素悬于甲醇中， 再加入80%水合肼回流反应1小时，过滤，洗涤 干燥。
B 叠氮法
• ⑶ 叠氮化。肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml 2% HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2反应20min， 过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶
• (4) 偶联：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸缓冲 液（内含250-500mg酶），5℃搅拌2-3小时，过滤，用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白酶（冻干保存）
β-硫酸酯乙砜基苯胺（SESA）反应，生成对氨基苯磺酰 乙基纤维素（ABSE-纤维素）。
• ⒉ 在盐酸和亚硝酸钠处理下把ABSE-纤维素变成重氮盐。
• ⒊ 把酶偶联于ABSE-纤维素上。
A．重氮法
方法如下：
• ⑴纤维素- OH的活化：0.6% NaOH调pH13 ,加热 85℃，30min
• ⑵ 醚化，先把SESA以1：2的水浸泡，在40℃时用 1M Na2CO3调pH为6.5，除去渣，以SESA：纤维素 =1：1（干重）在pH13，85℃，醚化30min，即得到 ABSE-纤维素。
• （ 3 ）所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团 副反应尽可能少。
• （ 4 ）要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位 阻对酶活力的影响。
（4）.共价键结合法制备固定化酶的“通式”
• 首先载体上引进活泼基团 • • 然后活化该活泼基团
关键
• 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
（5）载体活化的方法
• A．重氮法 • B．叠氮法 • C．烷基化反应法 • D．硅烷化法 • E．溴化氰法
A．重氮法
• 反应示意式如下
A．重氮法
• 目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基 （ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等
• 该方法需要载体具有芳香族氨基
A．重氮法
反应基本步骤： • ⒈ 甘蔗渣或纤维素（或其他多糖类载体在碱性条件下与
B 叠氮法
• 对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚 硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联
（三）交联法
• 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结 构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌 体碎片的固定化。
（三）交联法常用试剂
• 交联法一般步骤： • 固定化分两步进行 • 第一步形成可溶性分子间交联络合物 • 第二步是快速反应导致固化。
Km'=Km/ρ(表观米氏常数)
• （1） 载体与底物带相同电荷，[Si]<[S],ρ<1,Km’>Km 固定化酶降低了酶的亲和力。
• （2） 载体与底物电荷相反，静电作用，[Si]>[S]，则 ρ>1,Km'<Km
3.评价固定化酶的指标：
• 1．酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微
举例：
•
链霉蛋白酶55℃，120min全失活；用乙烯和马来酸
酐聚合物固定化后，相同条件下存活30%；用溴化氰活化
的纤维素固定化后，相同条件下存活50%。
用DEAE -纤维素通过离子结合固定化转化酶在40℃下 加热 30min活力仅存4%，而游离酶在同一条件下存在 100%。
固定化酶（细胞）热稳定性变化(延胡索酸酶，千烟一郎)
底物专一性
吸附法
结合法
物理吸附 .共价键结合 离子键结合
易 弱 较高 可能 低 不变
难 强 低 不可能 高 可变
易 中等 高 可能 低 不变
适用性
酶源多
较广
广泛
交联法
包埋法
较难 强
中等 不可能
中等 可变
较难 强 高
不可能 低
不变
较广
小分子底物、 药用酶
2． 选择方法依据： • （1） 酶的性质 • （2） 载体的性质 • （3） 制备方法的选择
固定化酶（细胞）对pH稳定性变化
固定化酶pH的变化
• 1） 载体带负电荷，最适pH向碱性方向移动。
3．固定化酶pH的变化
• 载体带正电荷，pH向酸性方向移动。
• （2）产物性质对pH的影响 • 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的操
作pH值比游离酶的pH值高；反之则低
4． 最适温度变化
• 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
• 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需 要的时间（t1/2）
3.评价固定化酶的指标：
• 3.
• 4.
或称偶联效率，活力保留百分数。 • 5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力
与游离酶活力的比值称为相对酶活力
第三节 固定化酶的制备 • 一． 一般方法及特点 • 二． 酶的固定化方法
A．重氮法例
• 5′-磷酸二酯酶的固定化。此酶用来降解核酸，可分离得到 四个5′-单核苷酸（本成果荣获国家发明三等奖，中国科学 院上海生化研究所袁中一等，我国第一个用于工业生产的 固定化酶）
B 叠氮法
•例
• 用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白 酶，步骤如下：
• ⑴ 酯化：CM-纤维素先洗涤干燥，然后悬于无 水甲醇中，在冰浴中通入HCl气体，进行酯化 反应；然后洗涤，空气干燥。
• 1．网格型 • 2．微囊型
1．网格型
• (1) 概念 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一 定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋 法
1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固 定化研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步 。
1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用 于DL-AA的光学分析，实现了酶连续反应的工业化 。这是世界上固定化酶用于工业的开端。
1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化 大肠杆菌细胞，成功实现了L-天冬氨酸连续生产。
A．重氮法
• ⑶ 去除多余的苯胺基(用0.5 M NaOH洗三次，水洗至无色） • ⑷ 重氮化盐制备。用5% NaNO2及1MHCl在10℃以下反应
15min，然后用预先冷却的0.05M HCl及H2O洗涤抽干即 成。 • ⑸ 偶联，先在酶液中加入硫酸铵（1：0.007）,然后调pH 值6.5，加入经重氮化的ABSE-纤维素，再调PH 值7.0， 在冰浴中反应两小时，过滤，洗涤抽干即为固定化酶，
细胞
非生长
生长
悬浮 固定化
酶液
固定化
材料
膜固定
连续
再循环系统
凝胶 吸附 化学连接物
半连续 分批
凝胶 吸附
生物催化剂
可溶
连续
吸附
包埋
间歇
间歇
酶 固定化
交联
化学连续 间歇
连续 活塞模式
搅拌连续反应器
连续 活塞模式 搅拌连续反应器
生物催化剂作用方式示意
1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了 酶 固定化研究，并第一次实现了酶的固定化。
戊二醛交联法
OHC(CH2)3CHO 戊二醛
H2N-E
-HC=N-E-N=CH（CH2）3-CH=N- E-
N
N
CH
CH
（三）交联法常用试剂
• 常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、双重氮联苯胺等。
• 应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质 的游离氨基形成席夫碱(shiff)
• 甲苯-2-异氰-4-异硫氰
• 常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体
❖ 载体上与酶偶联的基团：芳香氨基、羟基、羧基和羧甲基
（3）.共价偶联法中的几个影响因素
• （ 1 ）载体的物化性质要求载体亲水，并且有一定的机械强 度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团。
• （ 2 ）偶联反应的反应条件必须在温和pH、中等离子强度 和低温的缓冲溶液中。
固定化方法与载体的选择
1.必须注意维持酶的催化活性和专一性 2.酶与载体结合牢固 3.载体的机械强度 4.固定化酶要有最小的空间位阻 5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应 6.固定化酶要廉价
3． 固定化后酶的考察项目：
• （1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回 收率。
• （2） 考察固定化酶稳定性 • （ 3） 考察固定化酶最适反应条件
摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。 ——计量单位
1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/min =6*106IU
• 2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所 具有的酶活力单位 ——品质的体现
3.评价固定化酶的指标：
• 1. 固定化酶的比活：
每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位 面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。
• （1）酶蛋白N末端的α-氨基或赖氨酸残基的 ε-氨基。
• （2）酶蛋白C末端的α-羧基、天门冬氨酸残 基的β-羧基以及谷氨酸残基的γ-羧基。
• （3）苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。
酶蛋白上可供载体结合的功能基团
• （4）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪
氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲 哚基。
第二节 固定化酶的性质及其影响因素
• 一． 影响固定化酶性质的因素 • 二． 固定化后酶性质的变化 • 三． 评价固定化酶的指标
1.影响固定化酶性质的因素
1.酶本身的变化：主要是由于活性中心的氨基酸残 基、高级结构和电荷状态等发生了变化。
2.固定化方法的影响
1.影响固定化酶性质的因素 3．载体的影响
• 固定化酶
酶工业化应用着重解决的问题？
一 是改善其稳定性 可以实施连续操作 二 是要开发出一种经济的非破坏性的回收酶的方法
固定化
一 什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术
水不溶性酶（固定化酶）
•固定化酶:
•固定在载体上，并在一定范围内进行催化反应的酶。
第一节 概述 二 固定化酶的发展史
1） 分配效应 2） 空间障碍效应 3） 扩散限制效应
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液 称为宏观环境。
二．固定化后酶性质的变化-酶活性的影响
活力变化的原因：
1、酶分子在固定化过程中，空间构像可能发生了变化有时 活性中心的氨基酸也会参加反应。
2、固定化后的空间障碍效应的影响。 3、内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻 4、包埋法时高分子物质进入半透膜较困难
（三）交联法的形式
• 交联法有2种形式：
•
酶直接交联法
•
酶辅助蛋白交联
• 双重固定法
（1） 吸附交联法（壳状固定化酶）
• （2） 交联包埋法
（四） 包埋法（entrapping method）
• 定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使 酶固定化的方法称为包埋法。
（四） 包埋法
试剂（乙醇）稳定 性变化
固定化酶（细胞）对酶抑制剂（尿素）的稳 定性变化
2 ．固定化后酶稳定性提高的原因：
• a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 • b. 酶活力的释放是缓慢的。 • c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。
3． pH的变化-影响酶活的机理
• （1） 改变酶的空间构象 • （2）影响酶的催化基团的解离 • （3）影响酶的结合基团的解离 • （4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合 或结合后不能生成产物。
一． 一般方法及特点
关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研 究、改进。
1． 四大类方法： • 吸附法（包括电吸附法） • 结合法（无机多孔材料） • 交联法（双功能试剂） • 包埋法（微胶囊法）
• 吸附法 • 包埋法 • 共价结合法 • 交联法
各类固定化方法的特点比较:
比较项目
制备难易 固定化程度 活力回收率
2.固定化后酶性质的变化
• 结论-固定化对酶活性的影响：
1）酶活性下降 2）反应速度下降
二． 固定化酶的性质-对酶稳定性的影响
（1） 操作稳定性提高 （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 • (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 • (4 ) 对分解酶的稳定性提高。 • （5） 对变性剂的耐受力升高
• 5． 底物特异性变化
• 作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化
• 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。
固定化米氏方程推导
• 对简单的固定化酶系统，其动力学性质一般服从米氏方 程： 由于分配效应：ρ=[Si]微环境/[S]宏观环境
6． 米氏常数Km的变化，Km值 随载体性质变化
（一）结合法
• 1 离子键结合法 • 2 共价键结合法☆
2、共价结合（偶联）法
共价结合（偶联）法是目前研究中最为活跃的方法。它 的原理是酶蛋白分子上的功能基团和固相支持物表面上 的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在支持物上
（借助共价键将酶的非活性必需侧链基团和载体的功能 基团进行偶连）。
酶蛋白上可供载体结合的功能基团
• ⑵ 肼解。把酯化后的CM-纤维素悬于甲醇中， 再加入80%水合肼回流反应1小时，过滤，洗涤 干燥。
B 叠氮法
• ⑶ 叠氮化。肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml 2% HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2反应20min， 过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶
• (4) 偶联：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸缓冲 液（内含250-500mg酶），5℃搅拌2-3小时，过滤，用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白酶（冻干保存）
β-硫酸酯乙砜基苯胺（SESA）反应，生成对氨基苯磺酰 乙基纤维素（ABSE-纤维素）。
• ⒉ 在盐酸和亚硝酸钠处理下把ABSE-纤维素变成重氮盐。
• ⒊ 把酶偶联于ABSE-纤维素上。
A．重氮法
方法如下：
• ⑴纤维素- OH的活化：0.6% NaOH调pH13 ,加热 85℃，30min
• ⑵ 醚化，先把SESA以1：2的水浸泡，在40℃时用 1M Na2CO3调pH为6.5，除去渣，以SESA：纤维素 =1：1（干重）在pH13，85℃，醚化30min，即得到 ABSE-纤维素。
• （ 3 ）所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团 副反应尽可能少。
• （ 4 ）要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位 阻对酶活力的影响。
（4）.共价键结合法制备固定化酶的“通式”
• 首先载体上引进活泼基团 • • 然后活化该活泼基团
关键
• 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
（5）载体活化的方法
• A．重氮法 • B．叠氮法 • C．烷基化反应法 • D．硅烷化法 • E．溴化氰法
A．重氮法
• 反应示意式如下
A．重氮法
• 目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基 （ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等
• 该方法需要载体具有芳香族氨基
A．重氮法
反应基本步骤： • ⒈ 甘蔗渣或纤维素（或其他多糖类载体在碱性条件下与
B 叠氮法
• 对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚 硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联
（三）交联法
• 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结 构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌 体碎片的固定化。
（三）交联法常用试剂
• 交联法一般步骤： • 固定化分两步进行 • 第一步形成可溶性分子间交联络合物 • 第二步是快速反应导致固化。
Km'=Km/ρ(表观米氏常数)
• （1） 载体与底物带相同电荷，[Si]<[S],ρ<1,Km’>Km 固定化酶降低了酶的亲和力。
• （2） 载体与底物电荷相反，静电作用，[Si]>[S]，则 ρ>1,Km'<Km
3.评价固定化酶的指标：
• 1．酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微
举例：
•
链霉蛋白酶55℃，120min全失活；用乙烯和马来酸
酐聚合物固定化后，相同条件下存活30%；用溴化氰活化
的纤维素固定化后，相同条件下存活50%。
用DEAE -纤维素通过离子结合固定化转化酶在40℃下 加热 30min活力仅存4%，而游离酶在同一条件下存在 100%。
固定化酶（细胞）热稳定性变化(延胡索酸酶，千烟一郎)