药物靶标鉴定的思路与方法
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药物靶标鉴定的思路与方法
Small molecules
Target proteins
Drug discovery and
development
Cancer Res, 2013 PNAS, 2016
Nature Chemical Biology, 2018 Trends Biochem Sci, 2018
2. 药物开发 --- 结构优化 --- 高效低毒
3. 高水平研究论文
药物靶标-Polypharmacology
One drug one target One drug multiple targets
Nat Chem Biol. 2008;4(11):682-90.
鉴定药物靶标-How?
药物表型的 筛选/发现/鉴定
Rita Santos, Nature Reviews of Drug discovery,2017
What is the problems?
Endogenous vs Purified protein
--- Over 400 kinds of PTM --- Extensive protein-protein interactions --- Purification of full-length proteins --- Structural data are not available
MicroScale Thermophoresis (MST)
MicroScale Thermophoresis (MST)
Label-free ------Any small molecule ------No binding disruption
Purification-free ------Any protein ------Reaction buffer
用引起体系温度的变化 • 原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息，没有任何限制条件 蛋白热转移实验 （thermal shifting assay， TSA） • 在温度上升过程中，蛋白质构象逐渐发生改变，变性后暴露出的疏水基团可
以被检测出来 • 可以用于高通量筛选
Very few cancer drivers have been drugged
DMSO / Axitinib
Yi Qu, et al, PNAS, 2016
Validation of Direct binding Proteins
X-Ray
NMR
SPR
TSA
ITC
MST
X射线晶体法 （X-ray crystallography） • 利用电子对X射线的散射作用，X射线晶体学可以获得晶体中电子密度的分布
鉴定药物 直接结合蛋白
鉴定药物 功能靶标蛋白
基于靶标蛋 白的药物作
用机制
Profile binding protein- pulldown assay
Label-based vs Label free Exogenous vs Endogenous Non-specific vs Specific (N.C)
情况，再从中分析获得原子的位置信息，即晶体结构 核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR） • 原子核的核磁共振信号频率位置与所处的微观结构有关，提供分子结构信息 • 可以对溶液（非晶态）和不能结晶或结晶后构象会改变的蛋白质进行检 • 是X-ray以外最主要的蛋白质结构测定方法之一 表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance,SPR） • 利用表面等离子共振的物理光现象，非标 • 生物分子间结合特异性的分析、结合动力学和亲和力分析以及热力学分析 等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC） • 在绝热条件下，用一种反应物滴定另一种反应物，测量两者的化学或物理作
Trends Pharmacol Sci. 2018 Pharmacology & Therapeutics, 2018
药物靶标-What 药物靶标-Why 鉴定药物靶标-How 药物靶标蛋白-Definition
药物靶标-What?
Protein DNA RNA
药物靶标-Why?
1. 阐明药物作用分子机制 --- 关联性 --- 因果性
Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS)
1.无需标记药物 2.无差别发现直接结合蛋白 3.基于内源表达蛋白
Brett L, et al, PNAS, 2009
DARTS/2D-DIGE/Mass Spectrometry
DMSO
Axitinib
1. 通过生物化学或生物物理学方法证实药物与蛋白的直接作用 2. 通过共结晶或突变技术测定药物与蛋白的结合位点(氨基酸残基) 3. 药物处理细胞导致与蛋白功能相关的表型 4. 在细胞中突变该蛋白的结合位点，导致药物作用效应减少或消失
Repeating experiments is not enough
Endogenous protein ------PTM ------PPI
Functional target---Loss of Function
Protocol Knockout vs knockdown Lethality vs clone formation
CRISPR/
药物靶标蛋白的界定
Small molecules
Target proteins
Drug discovery and
development
Cancer Res, 2013 PNAS, 2016
Nature Chemical Biology, 2018 Trends Biochem Sci, 2018
2. 药物开发 --- 结构优化 --- 高效低毒
3. 高水平研究论文
药物靶标-Polypharmacology
One drug one target One drug multiple targets
Nat Chem Biol. 2008;4(11):682-90.
鉴定药物靶标-How?
药物表型的 筛选/发现/鉴定
Rita Santos, Nature Reviews of Drug discovery,2017
What is the problems?
Endogenous vs Purified protein
--- Over 400 kinds of PTM --- Extensive protein-protein interactions --- Purification of full-length proteins --- Structural data are not available
MicroScale Thermophoresis (MST)
MicroScale Thermophoresis (MST)
Label-free ------Any small molecule ------No binding disruption
Purification-free ------Any protein ------Reaction buffer
用引起体系温度的变化 • 原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息，没有任何限制条件 蛋白热转移实验 （thermal shifting assay， TSA） • 在温度上升过程中，蛋白质构象逐渐发生改变，变性后暴露出的疏水基团可
以被检测出来 • 可以用于高通量筛选
Very few cancer drivers have been drugged
DMSO / Axitinib
Yi Qu, et al, PNAS, 2016
Validation of Direct binding Proteins
X-Ray
NMR
SPR
TSA
ITC
MST
X射线晶体法 （X-ray crystallography） • 利用电子对X射线的散射作用，X射线晶体学可以获得晶体中电子密度的分布
鉴定药物 直接结合蛋白
鉴定药物 功能靶标蛋白
基于靶标蛋 白的药物作
用机制
Profile binding protein- pulldown assay
Label-based vs Label free Exogenous vs Endogenous Non-specific vs Specific (N.C)
情况，再从中分析获得原子的位置信息，即晶体结构 核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR） • 原子核的核磁共振信号频率位置与所处的微观结构有关，提供分子结构信息 • 可以对溶液（非晶态）和不能结晶或结晶后构象会改变的蛋白质进行检 • 是X-ray以外最主要的蛋白质结构测定方法之一 表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance,SPR） • 利用表面等离子共振的物理光现象，非标 • 生物分子间结合特异性的分析、结合动力学和亲和力分析以及热力学分析 等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC） • 在绝热条件下，用一种反应物滴定另一种反应物，测量两者的化学或物理作
Trends Pharmacol Sci. 2018 Pharmacology & Therapeutics, 2018
药物靶标-What 药物靶标-Why 鉴定药物靶标-How 药物靶标蛋白-Definition
药物靶标-What?
Protein DNA RNA
药物靶标-Why?
1. 阐明药物作用分子机制 --- 关联性 --- 因果性
Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS)
1.无需标记药物 2.无差别发现直接结合蛋白 3.基于内源表达蛋白
Brett L, et al, PNAS, 2009
DARTS/2D-DIGE/Mass Spectrometry
DMSO
Axitinib
1. 通过生物化学或生物物理学方法证实药物与蛋白的直接作用 2. 通过共结晶或突变技术测定药物与蛋白的结合位点(氨基酸残基) 3. 药物处理细胞导致与蛋白功能相关的表型 4. 在细胞中突变该蛋白的结合位点，导致药物作用效应减少或消失
Repeating experiments is not enough
Endogenous protein ------PTM ------PPI
Functional target---Loss of Function
Protocol Knockout vs knockdown Lethality vs clone formation
CRISPR/
药物靶标蛋白的界定