牛血清蛋白稀溶液的粘度研究
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虽然吸附量增大了，由于是单层吸附，吸附层的有效厚度反而降低。温度进一步降低，吸附 量增大到超过单层最大饱和吸附量后，分子开始形成第二层吸附，这时吸附层的厚度才开始 成比例的增加。
4. 结论
（1） 牛血清蛋白水溶液在稀溶液区出现了表观粘度上弯现象是由于溶质吸附在玻璃毛细 管管壁上引起的界面现象；
T, oC
图 6 牛血清蛋白在毛细管内壁的吸附量与吸附层厚度的比较 Fig 6 Comparison of adsorption amount and adsorption layer thickness for BSA on the inner wall of glass capillary
T d e c re a s in g
3. 结果与讨论
η r
1.045 1.040 1.035 1.030 1.025 1.020 1.015 1.010 1.005 1.000
0.000
0.001
0.002
0.003
C, g/ml
0.004
45oC 35oC 25oC 15oC
0.005
0.006
图 2 牛血清蛋白水溶液的相对粘度的浓度依赖性，虚线是线性回归线。 Fig 2 Plots of relative viscosity versus concentration of BSA aqueous solution in the extremely dilute
表 1 在玻璃毛细管粘度计中测量牛血清蛋白水溶液得到的粘度参数
Table 1 Viscosity parameters of aqueous solution of BSA measured in glass capillary viscometer.
Temperature, ℃
k
beff
[η],
nm
图 7 BSA 分子在毛细管壁吸附示意图 Fig 7 Schematic illustration of BSA adsorption on the inner wall of glass capillary
为了解释吸附数据的这种异常变化，我们提出了一个简化的吸附模型，如图 7 所示。 BSA 分子被假定为椭圆球体，但是分子是“可压缩变形”的。由于是极稀溶液，且分子的吸 附量非常低，分子主要采取单层吸附，并以横轴平行于表面的（侧向）方式吸附到玻璃毛细 管内壁上。只有表面达到最大单层吸附后才开始多层吸附，饱和吸附时未必达到最大单层吸 附。结合 BSA 分子在溶液中的构象，我们认为，随着温度降低，溶液中的分子进一步伸展， 分子的纵轴缩短，吸附到表面的分子也更铺展，导致吸附分子的平均高度降低，分子变“扁”。
2E-5
1E-18
0
从表 1 看，自缔合常数在所有温度下都是零，意味着牛血清蛋白分子在稀溶液中处于 孤立状态。从图 1 可见，牛血清蛋白分子带负的净电荷，在稀溶液中分子之间由于静电斥力 相互远离。因此分子尺寸的变化只与分子本身的展开程度有关。根据 Flory 方程，
[η] = Φ ⋅ (r2 )3/2 Mw
从界面参数 k 计算出的有效吸附层厚度 beff 的数值也列在表 1 中。从 k 和 beff 的数值看， 它们随温度的改变并没有规律可寻。而且 beff 远大于牛血清蛋白分子的长轴长度，即使考虑
多层吸附，也相差很大。这说明牛血清蛋白的有效吸附层厚度不仅包括吸附分子链的实际吸 附层厚度，还包括一个排斥层厚度，如图 5 所示。流动溶液中的牛血清蛋白分子与吸附的分 子之间存在库仑斥力，使得流动的分子与固定的分子之间有一定的距离，此距离即为排斥层 厚度。
-4-
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离解使得表面略带负电，从而与带负的净电荷的牛血清蛋白分子之间相互排斥。但是一旦分 子吸附到表面上，分子内部带正电荷的基团会与表面带负电的基团结合，因此分子的吸附是
十分牢固的。我们将 beff 和 A 进行了比较，如图 6 所示。从 15℃到 25℃，吸附量与吸附层
concentration region.
牛血清蛋白水溶液的相对粘度的浓度依赖性如图 2 所示。随着浓度增加，溶液的粘度增 大，但是很明显当 C 趋向 0 时，相对粘度并不等于 1。显然测量时的界面条件已经发生变化。 从相对粘度计算出的比浓增比粘度随浓度的变化如图 3 所示。在低浓度区粘度曲线均出现了 上弯现象，我们认为这同样是界面吸附造成的，按照第二章中提出的程序处理方法得到了牛 血清的粘度参数，结果列在表 1 中。将表 1 中的参数代入方程 1 计算出 ηsp/C0，也一同画于 图 3 上，结果显示计算值与实验值吻合的很好。
adsorbed m olecule on the capillary wall
bads
b exclusion b e ff
Flowing m olecule in solution
图 5 在 BSA 粘度测量过程中吸附分子的有效吸附层厚度示意图 Fig 5 Schematic illustration of the effctive adsorption layer thickness during the viscosity measurement
-3-
4 所示，牛血清蛋白分子可以从 N-形状变到 E-形状。
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N-form
F-form
E-form
图 4 牛血清蛋白分子构象伸展示意图 Fig 4 Schematic illustration of the development of BSA molecule
2.2 粘度测量
粘度计先经充分清洗（热铬酸洗液浸泡后再用热二次蒸馏水反复清洗，再用超声波清 洗），在普通烘箱中于125 oC干燥待用。在溶液配制和测量粘度时采用了称重和逐步加浓溶 液的方法。首先测量已知重量的溶剂（二次蒸馏水）在粘度计中的流过时间t0，再用称量法 逐次向粘度计内加入同样以称量法配制的牛血清蛋白浓溶液（母液），依次测量粘度计中各 个浓度溶液的流过时间ts，ts与t0的比值即视作相对粘度。忽略动能校正。重量浓度再经密度 校正后得到重量-体积浓度。溶剂（纯水）的流过时间分别为500.33s（15℃）、390.97s（25℃）、 317.38s（35℃）、264.22s（45℃）
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牛血清蛋白稀溶液的粘度研究1
李艺 1，蔡正春 1，程镕时 1,2
1 南京大学化学化工学院，南京 (210093) 2 华南理工大学材料科学与工程学院，广州 (510640)
E-mail：rscheng@nju.edu.cn
摘 要：本文测量了 15-40℃之间不加盐的牛血清蛋白水溶液的粘度随浓度的变化，发现： 牛血清蛋白是一种“硬蛋白”，从特性粘数估算出的分子尺寸随温度的变化很小，它在毛细管 玻璃内表面的吸附量很低。自缔合常数在所有温度下都为零，证实了它难于聚集的特点。牛 血清分子吸附后会发生构象变化，表现为分子变“扁”。当温度降低吸附量增大后，吸附层的 厚度出现了先减小后增大的现象，考虑到牛血清蛋白在界面以单层吸附为主的特点，我们推 测由于分子在界面上随着温度降低进一步铺展，导致吸附层的平均高度降低。其后吸附层的 厚度的增大是由于单层吸附量达到最大饱和值后开始出现多层吸附所致。有效吸附层厚度远 大于分子在溶液中的尺寸，是由于分子之间存在库仑斥力，导致吸附分子和流动分子之间存 在一个排斥层。 关键词：粘度，牛血清蛋白，吸附
1. 引言
血清蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，也是研究得最多的蛋白质之一。早期人们通过 流体力学和小角光散射实验假定牛血清蛋白分子的结构为扁平的椭圆体，尺寸为140 × 40Å。 分子的二级结构中包含68%~50%的α螺旋和16% -18%的β折叠。但是后来的核磁共振和X-射 线结晶数据显示牛血清蛋白分子更像是心型结构，天然血清分子的结构中包含55%的α螺旋 和45%的无规线团，不含有β折叠。加热后分子中的α螺旋含量降低，同时生成β折叠（65℃ 以上）。BSA分子中包括三个同源的区（I，II，III），含17根双硫键，但是这些区所带的电荷 是不同的，图1为pH中性时BSA分子的结构示意图[1]。BSA分子的一级结构电荷分布不均匀， 但是BSA分子的三级结构的电荷分布是相当均匀的。与其它蛋白质相比，由于牛血清蛋白较 少出现聚集，因此经常作为理想的硬球模型来研究在化学变性中的折叠和伸展行为[2]。 Peter[169]等曾报导BSA的特性粘数值为3.7~4.2ml/g，但是随着双硫键分裂的增加，特性粘数 值会增大，而流体力学分子轴比会从4大约上升到9。BSA溶液的粘度随浓度增加线性增大， 直到浓度>6.5mg/ml后开始呈指数级的增长。
厚度的变化是一致的，但是温度继续升高，吸附量与吸附层厚度出现了相反的变化。
A, g/ml
b , nm eff
350 6.00E-017
300 5.00E-017
4.00E-017
250
3.00E-017 200
2.00E-017
150 1.00E-017
0.00E+000
100
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48
图 1 牛血清蛋白分子结构示意图 Fig. 1 Structure of BSA molecule
本文测量了不同温度下不加盐的牛血清蛋白水溶液的粘度随浓度的变化，并利用有浓度 校正的粘度公式 1[3-6]，
1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20030284003）的资助。
-1-
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（2） 随着温度降低牛血清蛋白分子的构象变得更加伸展，表现为特性粘数的增加和表面 吸附层厚度的降低；
for BSA aqueous solution
比较表 1 中的参数 A 和 Ca 的数值，发现温度愈低，吸附量愈大，毛细管内壁的覆盖率 达到一半时的浓度愈低，表明吸附愈易达到饱和。由于 A 的数值相当低，表明在亲水的玻 璃表面 BSA 分子吸附很少，这可能是由于玻璃表面主要是一些硅羟基，在中性溶液条件下
( ) η sp =
1 + [η ] ⋅ C + 6 ⋅ K m ⋅ [η ] ⋅ C 2
⋅
⎛ ⎜
1
+
⎝
k
⋅
C Ca +
C
⎞ ⎟ ⎠
−1
C
C
（1）
从实验粘度数据得到牛血清蛋白的粘度参数。并对同时得到的吸附参数进行分析，从而加深
理解牛血清蛋白在毛细管壁的吸附行为。
2. 实验部分
2.1 原料和仪器
牛血清蛋白（V），上海华美生物制药公司。MW 为 66500Da。 乌氏粘度计（自制），玻璃毛细管直径为0.20mm。 精密恒温槽，精度±0.01oC，JWC-52 型，上海思尔达科学仪器有限公司。
concentration region.
-2-
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100
45oC
35oC
80
25oC
15oC
60
η /C, ml/g sp
40
20
0 1E-4
1E-3
0.01
C, g/ml
图 3 牛血清蛋白水溶液的比浓增比粘度的浓度依赖性（虚线是计算线）。 Fig 3 Plots of reduced viscosity versus concentration of BSA aqueous solution in the extremely dilute
ml/g
Ca×105, g/ml
A×105 Km
g/ml
15
0.00460 229.3 8.6042
1.00E-19
5.68E-17
0
25
0.00191 95.4 8.0573
5.49E-6
2E-17
0
35
0.00364 181.6 6.4504
1E-5
1E-17
0
45
0.00655 326.2 5.1667
（2）
从特性粘数估算出的 (r 2 )1/ 2 在 15℃、25℃、35℃、45℃分别为 139.7Ǻ、136.6Ǻ、126.9Ǻ 和
117.8Ǻ，落在文献的完全伸展半径 81.8Å 和完全未伸展半径 33.9Å 范围外[7]。说明牛血清分 子在实验温度范围内处于完全伸展构象状态。随着温度降低，分子的伸展程度增加。由于牛 血清蛋白是球形分子，分子链的运动是受限的，其构象伸展主要与双硫键的分裂有关。如图
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虽然吸附量增大了，由于是单层吸附，吸附层的有效厚度反而降低。温度进一步降低，吸附 量增大到超过单层最大饱和吸附量后，分子开始形成第二层吸附，这时吸附层的厚度才开始 成比例的增加。
4. 结论
（1） 牛血清蛋白水溶液在稀溶液区出现了表观粘度上弯现象是由于溶质吸附在玻璃毛细 管管壁上引起的界面现象；
T, oC
图 6 牛血清蛋白在毛细管内壁的吸附量与吸附层厚度的比较 Fig 6 Comparison of adsorption amount and adsorption layer thickness for BSA on the inner wall of glass capillary
T d e c re a s in g
3. 结果与讨论
η r
1.045 1.040 1.035 1.030 1.025 1.020 1.015 1.010 1.005 1.000
0.000
0.001
0.002
0.003
C, g/ml
0.004
45oC 35oC 25oC 15oC
0.005
0.006
图 2 牛血清蛋白水溶液的相对粘度的浓度依赖性，虚线是线性回归线。 Fig 2 Plots of relative viscosity versus concentration of BSA aqueous solution in the extremely dilute
表 1 在玻璃毛细管粘度计中测量牛血清蛋白水溶液得到的粘度参数
Table 1 Viscosity parameters of aqueous solution of BSA measured in glass capillary viscometer.
Temperature, ℃
k
beff
[η],
nm
图 7 BSA 分子在毛细管壁吸附示意图 Fig 7 Schematic illustration of BSA adsorption on the inner wall of glass capillary
为了解释吸附数据的这种异常变化，我们提出了一个简化的吸附模型，如图 7 所示。 BSA 分子被假定为椭圆球体，但是分子是“可压缩变形”的。由于是极稀溶液，且分子的吸 附量非常低，分子主要采取单层吸附，并以横轴平行于表面的（侧向）方式吸附到玻璃毛细 管内壁上。只有表面达到最大单层吸附后才开始多层吸附，饱和吸附时未必达到最大单层吸 附。结合 BSA 分子在溶液中的构象，我们认为，随着温度降低，溶液中的分子进一步伸展， 分子的纵轴缩短，吸附到表面的分子也更铺展，导致吸附分子的平均高度降低，分子变“扁”。
2E-5
1E-18
0
从表 1 看，自缔合常数在所有温度下都是零，意味着牛血清蛋白分子在稀溶液中处于 孤立状态。从图 1 可见，牛血清蛋白分子带负的净电荷，在稀溶液中分子之间由于静电斥力 相互远离。因此分子尺寸的变化只与分子本身的展开程度有关。根据 Flory 方程，
[η] = Φ ⋅ (r2 )3/2 Mw
从界面参数 k 计算出的有效吸附层厚度 beff 的数值也列在表 1 中。从 k 和 beff 的数值看， 它们随温度的改变并没有规律可寻。而且 beff 远大于牛血清蛋白分子的长轴长度，即使考虑
多层吸附，也相差很大。这说明牛血清蛋白的有效吸附层厚度不仅包括吸附分子链的实际吸 附层厚度，还包括一个排斥层厚度，如图 5 所示。流动溶液中的牛血清蛋白分子与吸附的分 子之间存在库仑斥力，使得流动的分子与固定的分子之间有一定的距离，此距离即为排斥层 厚度。
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离解使得表面略带负电，从而与带负的净电荷的牛血清蛋白分子之间相互排斥。但是一旦分 子吸附到表面上，分子内部带正电荷的基团会与表面带负电的基团结合，因此分子的吸附是
十分牢固的。我们将 beff 和 A 进行了比较，如图 6 所示。从 15℃到 25℃，吸附量与吸附层
concentration region.
牛血清蛋白水溶液的相对粘度的浓度依赖性如图 2 所示。随着浓度增加，溶液的粘度增 大，但是很明显当 C 趋向 0 时，相对粘度并不等于 1。显然测量时的界面条件已经发生变化。 从相对粘度计算出的比浓增比粘度随浓度的变化如图 3 所示。在低浓度区粘度曲线均出现了 上弯现象，我们认为这同样是界面吸附造成的，按照第二章中提出的程序处理方法得到了牛 血清的粘度参数，结果列在表 1 中。将表 1 中的参数代入方程 1 计算出 ηsp/C0，也一同画于 图 3 上，结果显示计算值与实验值吻合的很好。
adsorbed m olecule on the capillary wall
bads
b exclusion b e ff
Flowing m olecule in solution
图 5 在 BSA 粘度测量过程中吸附分子的有效吸附层厚度示意图 Fig 5 Schematic illustration of the effctive adsorption layer thickness during the viscosity measurement
-3-
4 所示，牛血清蛋白分子可以从 N-形状变到 E-形状。
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F-form
E-form
图 4 牛血清蛋白分子构象伸展示意图 Fig 4 Schematic illustration of the development of BSA molecule
2.2 粘度测量
粘度计先经充分清洗（热铬酸洗液浸泡后再用热二次蒸馏水反复清洗，再用超声波清 洗），在普通烘箱中于125 oC干燥待用。在溶液配制和测量粘度时采用了称重和逐步加浓溶 液的方法。首先测量已知重量的溶剂（二次蒸馏水）在粘度计中的流过时间t0，再用称量法 逐次向粘度计内加入同样以称量法配制的牛血清蛋白浓溶液（母液），依次测量粘度计中各 个浓度溶液的流过时间ts，ts与t0的比值即视作相对粘度。忽略动能校正。重量浓度再经密度 校正后得到重量-体积浓度。溶剂（纯水）的流过时间分别为500.33s（15℃）、390.97s（25℃）、 317.38s（35℃）、264.22s（45℃）
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牛血清蛋白稀溶液的粘度研究1
李艺 1，蔡正春 1，程镕时 1,2
1 南京大学化学化工学院，南京 (210093) 2 华南理工大学材料科学与工程学院，广州 (510640)
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摘 要：本文测量了 15-40℃之间不加盐的牛血清蛋白水溶液的粘度随浓度的变化，发现： 牛血清蛋白是一种“硬蛋白”，从特性粘数估算出的分子尺寸随温度的变化很小，它在毛细管 玻璃内表面的吸附量很低。自缔合常数在所有温度下都为零，证实了它难于聚集的特点。牛 血清分子吸附后会发生构象变化，表现为分子变“扁”。当温度降低吸附量增大后，吸附层的 厚度出现了先减小后增大的现象，考虑到牛血清蛋白在界面以单层吸附为主的特点，我们推 测由于分子在界面上随着温度降低进一步铺展，导致吸附层的平均高度降低。其后吸附层的 厚度的增大是由于单层吸附量达到最大饱和值后开始出现多层吸附所致。有效吸附层厚度远 大于分子在溶液中的尺寸，是由于分子之间存在库仑斥力，导致吸附分子和流动分子之间存 在一个排斥层。 关键词：粘度，牛血清蛋白，吸附
1. 引言
血清蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，也是研究得最多的蛋白质之一。早期人们通过 流体力学和小角光散射实验假定牛血清蛋白分子的结构为扁平的椭圆体，尺寸为140 × 40Å。 分子的二级结构中包含68%~50%的α螺旋和16% -18%的β折叠。但是后来的核磁共振和X-射 线结晶数据显示牛血清蛋白分子更像是心型结构，天然血清分子的结构中包含55%的α螺旋 和45%的无规线团，不含有β折叠。加热后分子中的α螺旋含量降低，同时生成β折叠（65℃ 以上）。BSA分子中包括三个同源的区（I，II，III），含17根双硫键，但是这些区所带的电荷 是不同的，图1为pH中性时BSA分子的结构示意图[1]。BSA分子的一级结构电荷分布不均匀， 但是BSA分子的三级结构的电荷分布是相当均匀的。与其它蛋白质相比，由于牛血清蛋白较 少出现聚集，因此经常作为理想的硬球模型来研究在化学变性中的折叠和伸展行为[2]。 Peter[169]等曾报导BSA的特性粘数值为3.7~4.2ml/g，但是随着双硫键分裂的增加，特性粘数 值会增大，而流体力学分子轴比会从4大约上升到9。BSA溶液的粘度随浓度增加线性增大， 直到浓度>6.5mg/ml后开始呈指数级的增长。
厚度的变化是一致的，但是温度继续升高，吸附量与吸附层厚度出现了相反的变化。
A, g/ml
b , nm eff
350 6.00E-017
300 5.00E-017
4.00E-017
250
3.00E-017 200
2.00E-017
150 1.00E-017
0.00E+000
100
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48
图 1 牛血清蛋白分子结构示意图 Fig. 1 Structure of BSA molecule
本文测量了不同温度下不加盐的牛血清蛋白水溶液的粘度随浓度的变化，并利用有浓度 校正的粘度公式 1[3-6]，
1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20030284003）的资助。
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（2） 随着温度降低牛血清蛋白分子的构象变得更加伸展，表现为特性粘数的增加和表面 吸附层厚度的降低；
for BSA aqueous solution
比较表 1 中的参数 A 和 Ca 的数值，发现温度愈低，吸附量愈大，毛细管内壁的覆盖率 达到一半时的浓度愈低，表明吸附愈易达到饱和。由于 A 的数值相当低，表明在亲水的玻 璃表面 BSA 分子吸附很少，这可能是由于玻璃表面主要是一些硅羟基，在中性溶液条件下
( ) η sp =
1 + [η ] ⋅ C + 6 ⋅ K m ⋅ [η ] ⋅ C 2
⋅
⎛ ⎜
1
+
⎝
k
⋅
C Ca +
C
⎞ ⎟ ⎠
−1
C
C
（1）
从实验粘度数据得到牛血清蛋白的粘度参数。并对同时得到的吸附参数进行分析，从而加深
理解牛血清蛋白在毛细管壁的吸附行为。
2. 实验部分
2.1 原料和仪器
牛血清蛋白（V），上海华美生物制药公司。MW 为 66500Da。 乌氏粘度计（自制），玻璃毛细管直径为0.20mm。 精密恒温槽，精度±0.01oC，JWC-52 型，上海思尔达科学仪器有限公司。
concentration region.
-2-
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100
45oC
35oC
80
25oC
15oC
60
η /C, ml/g sp
40
20
0 1E-4
1E-3
0.01
C, g/ml
图 3 牛血清蛋白水溶液的比浓增比粘度的浓度依赖性（虚线是计算线）。 Fig 3 Plots of reduced viscosity versus concentration of BSA aqueous solution in the extremely dilute
ml/g
Ca×105, g/ml
A×105 Km
g/ml
15
0.00460 229.3 8.6042
1.00E-19
5.68E-17
0
25
0.00191 95.4 8.0573
5.49E-6
2E-17
0
35
0.00364 181.6 6.4504
1E-5
1E-17
0
45
0.00655 326.2 5.1667
（2）
从特性粘数估算出的 (r 2 )1/ 2 在 15℃、25℃、35℃、45℃分别为 139.7Ǻ、136.6Ǻ、126.9Ǻ 和
117.8Ǻ，落在文献的完全伸展半径 81.8Å 和完全未伸展半径 33.9Å 范围外[7]。说明牛血清分 子在实验温度范围内处于完全伸展构象状态。随着温度降低，分子的伸展程度增加。由于牛 血清蛋白是球形分子，分子链的运动是受限的，其构象伸展主要与双硫键的分裂有关。如图