肿瘤侵袭和转移的恶性生物行为及分子干预

项目名称：肿瘤侵袭和转移的恶性生物行为及分子
干预
首席科学家：詹启敏中国医学科学院肿瘤医院肿瘤
研究所
起止年限：2009.1至2013.8
依托部门：教育部
一、研究内容1．细胞周期调控异常与肿瘤恶性增殖、侵袭相关分子机理
肿瘤是一种“细胞转导通路异常”性疾病,我们将通过分子生物学、细胞生物学、和动物模型相结合的研究技术，重点研究抑癌基因p53、BRCA1、Gadd45介导的信号通路与细胞周期蛋白Aurora-A、Cyclin B1、Plk1的相互作用，以及在细胞周期调控和肿瘤恶性表型形成中的生物学功能和分子机制。

从而揭示细胞增殖失调与肿瘤侵袭转移的内在联系。

2．细胞凋亡和分化异常与肿瘤侵袭性生长的关系
细胞凋亡调控机制的异常与侵袭特性生长密切相关。

促进细胞死亡的机制失活和抑制凋亡的分子的大量表达使癌症细胞存活延长，使基因突变的积累和癌变机会的增加，同时凋亡机制的异常导致肿瘤细胞具有抗药性。

通过对细胞死亡新机制、肿瘤干细胞凋亡相关研究、细胞信号转导与凋亡调控等研究，深入探讨侵袭性生长的机制。

3．肿瘤干细胞和肿瘤微环境与肿瘤转移的内在关系
以恶性肿瘤干细胞特异性表型为突破口，从白血病干细胞延伸至实体瘤干细胞，研究其自我更新和分化的特性，探讨肿瘤转移的起始因素和关键分子生物学性质，认别恶性肿瘤干细胞与微环境或肿瘤“基质”间的相互作用机制,从而为特异性打击肿瘤干细胞作为彻底消除肿瘤转移潜能的一种新策略提供重要的理论基础。

4. 肿瘤血管和淋巴管新生介导的肿瘤转移机制
已鉴定肿瘤组织中血管表达Tim-3和淋巴管表达Sema4c等是沉默抗肿瘤免疫的重要活性分子，能通过与淋巴细胞的对话，诱导机体对肿瘤的免疫耐受，是新发现的肿瘤免疫逃避机制。

在本项目中我们拟进一步研究血管和淋巴管促肿瘤转移的动力学，应用切片流式细胞仪等最新一代高通量组织和细胞分析平台，确定血管和淋巴管中预示早期肿瘤转移的始动免疫分子和对其进行靶向干预策略的有效性。

5. 肿瘤转移标记物与肿瘤转移靶向识别
将在前期工作的基础上，开展肿瘤标志物的应用及相关机制研究，着重围绕针对肿瘤转移病灶的标志物及对肿瘤细胞恶性生物行为影响的分子机制进行研
究；将以与肿瘤转移密切相关的酪氨酸磷酸酶PRL-3和促干细胞生长因子Hiwi 为切入点，深入研究PRL-3的促肿瘤转移机制；并通过活体成像标记达到准确识别微转移病灶的目的。

6. 肿瘤转移潜伏细胞和微转移病灶的早期诊断及清除
将利用针对亚临床微小转移病灶的靶向多肽，与促凋亡蛋白TRAIL、白喉毒素及化疗药物与其融合，制备一批针对亚临床微小转移病灶的导向生物治疗制剂，实现对肿瘤微小转移病灶的靶向杀伤作用。

并通过调控免疫应答，筛选肿瘤细胞抗原肽特异性亲和配体，增强抗原提呈，促进导向生物制剂有效清除微小肿瘤病灶。

7．恶性肿瘤增殖拮抗阻遏研究
研究作用于多环节阻遏肿瘤转移的新型制剂是治疗肿瘤的发展方向。

以肿瘤相关基因、信号转导分子等为靶点，采用转基因、RNA干扰技术和小分子药物设计等手段，阐明肿瘤增殖阻遏分子作用机制。

研究针对肿瘤增殖与转移作用的生物治疗剂和小分子物质，并建立实时观察肿瘤生成与转移的示踪方法，观察体内的抗肿瘤生长与转移的效果，为新型肿瘤增殖阻遏剂的研究提供理论基础。

8．肿瘤侵袭、转移分子靶向干预
在前期研究中，我们已经筛选出一批肿瘤转移肿瘤相关基因和调节因子，包括LASS2、BACP、HPO、Mag、Ceap、BPY2IP1、DACT1、LOC374946、4OF7、Sema4C和Tim3等，我们将深入研究其生物性状并筛选或合成相应小分子拮抗剂，应用模式生物进行验证。

同时致力于改造新一代靶向载体，为肿瘤转移靶向分子干预提供有利条件。

二、预期目标总体目标
本项目将以建立阻断肿瘤转移有效方法、改善肿瘤患者预后、保障人类健康为目标，分析肿瘤恶性生物学行为的基本生物要素和演化过程，揭示肿瘤恶性增殖和侵袭表型与肿瘤转移潜能的内在联系。

以严重危害我国人民生命健康的1～2种肿瘤（如食管癌、肝癌）为主要对象，从肿瘤侵袭、转移多元调节机制研究入手，提出肿瘤转移分子干预的新思路和新途径，建立阻遏肿瘤转移的有效手段。

本项目重点放在研究肿瘤细胞恶性生物行为和肿瘤转移分子干预，瞄准国际发展前沿的基础上，密切结合我国实际情况，争取获得一批具有我国自主知识产权的肿瘤转移相关靶基因、关键靶分子；对前期工作基础中发现的肿瘤转移新的机制在更大规模、更多肿瘤病种中加以研究；引入新的分子治疗手段，使我国在分子治疗上逐步形成自主创新的能力。

经过5年项目实施，预期在控制肿瘤侵袭、阻断肿瘤转移专项研究中获得若干突破，最终使我国在控制肿瘤侵袭转移的基础和应用研究方面与国际前沿接轨并在国际同领域研究中占据重要地位，加速我国抗肿瘤生物高科技产业的建立和发展。

五年目标
1.明确肿瘤干细胞的转移表型：自我更新是所有干细胞的主要特性之一。

对于
肿瘤干细胞来说，这一特性尤为重要。

肿瘤干细胞自我更新和成瘤的分子机制目前还不清楚。

我们拟研究在肿瘤干细胞中具有特异表达的分子，观察这些特异性分子和肿瘤克隆与肿瘤转移潜能的内在联系，从干细胞的自我更新的角度为寻找特异遏制肿瘤转移的方法提供理论基础和前期实验数据。

2.确定细胞恶性生物行为与肿瘤侵袭性生长、转移潜能的分子分型：肿瘤是一
种“细胞转导通路异常”性疾病, 根据前期“ 973”筛选出的关键分子，将转移性肿瘤的分子划分成若干“细胞转导通路异常”亚型。

在每种亚型中确定若干反映该通路功能状况的“检测分子”和逆转功能异常的“药靶分子”。

通过新一代高通量细胞分析仪确定新的信号传导通路和调节位点。

3.明确促进肿瘤转移生物行为形成的微环境机制：揭示肿瘤细胞与肿瘤微环境
相互作用中关键的肿瘤免疫逃逸机制，肿瘤“基质”在肿瘤转移中的重要作用；
并重点研究肿瘤血管内皮细胞，淋巴管内皮细胞与生理性血管和淋巴管生成机制的差异，确定可能的肿瘤转移干扰阻断靶点。

4.进行肿瘤标志物、靶向肽、特异性抗体和小分子拮抗剂等针对微小潜伏肿瘤
病灶或残留肿瘤细胞的分子药靶的筛选、鉴定或合成，建立旨在彻底清除微小潜伏肿瘤病灶或残留肿瘤细胞的有效方法。

5.建立多种分子模型和模式动物学模型，改进完善用于本项目分子机理研究（如
细胞增殖、凋亡和分化）的技术体系，建立我国肿瘤转移相关基因文库，创建新的一批分析系统和技术支撑平台。

筛选肿瘤转移的特异性拮抗剂，验证可能作为阻断肿瘤侵袭、转移药靶的有效性和临床实用性，从功能效应的角度出发，在分子、细胞、组织和整体水平设置验证分析体系。

6.培养一批在国际肿瘤学界有竞争力的中青年科学家，造就我国肿瘤侵袭、转
移研究领域学术群体强势，集中我国专家的攻关能力，取得若干重大突破，建立我国发展抗肿瘤生物高科技产业的技术平台和试验基地。

7.通过组织和集中我国专家的攻关能力，使该项目取得若干重大突破，大大提
升我国在该领域的研究水平，确立在国际上的先进地位。

研究成果主要以研究论文和独立开发的技术成果（专利）形式公布，计划在国内外发表学术论文300篇左右，着重在国外核心刊物发表学术论文60篇左右，力争在Science 或Nature发表1~2篇论文，申报专利10项。

并将研究成果有计划纳入国家863新技术和新药开发进程。

三、研究方案
(一)总体学术思路
本项目以探索肿瘤侵袭转移的基本规律，并建立较为有效的阻遏方法为基本出发点，提出新的研究思路：(1)从细胞周期调控、细胞分化、细胞凋亡、肿瘤干细胞、血管生成、肿瘤微环境等方面深入研究肿瘤侵袭、转移的恶性生物学行为，建立干预肿瘤转移的有效措施，使潜伏在肿瘤患者体内的残留癌细胞的增殖分化与凋亡达到动态平衡，肿瘤患者处于健康状态下的带瘤细胞生存；(2)通过肿瘤标志物、靶向肽、特异性抗体和小分子拮抗剂等针对微小潜伏肿瘤病灶或残留肿瘤细胞的分子药靶的筛选、鉴定或合成，建立旨在彻底清除微小潜伏肿瘤病灶或残留肿瘤细胞的有效方法，从而最大限度减少肿瘤复发转移的可能性。

通过功能效应和临床整体验证的角度来检验分子干预的有效性和实用性，真正做到有效控制肿瘤复发转移，保护患者健康。

(二)技术路线
(三) 创新点与特色
1.从多层次和多学科交叉入手，围绕恶性肿瘤恶性生物学行为对细胞增殖、转
移的影响这一肿瘤研究的关键问题，结合我国已有的研究积累和基础，探索恶性肿瘤相关基因、功能蛋白、信号分子等可能的分子干预机制。

2.在遵循肿瘤侵袭转移的生物规律，建立有效的分子干预方法的基本观点上，
提出在保持肿瘤患者健康状态下的带瘤细胞生存的新思路，作为控制肿瘤复发转移的基本要素。

3.恶性肿瘤复发转移是在临床治疗达到痊愈后以潜伏肿瘤病灶或残留瘤细胞复
燃为基础，因此，通过特异性靶向识别和清除微小潜伏肿瘤病灶或残留肿瘤细胞，清除肿瘤复发转移的可能性为本项目长远目标或最终目的。

4.将研究以肿瘤干细胞特异性表型为突破口，研究恶性肿瘤干细胞分化和自我
更新的生物学基础，为识别肿瘤转移的起始因素和关键细胞生物学性质、建立特异性清除肿瘤干细胞提供重要的理论基础。

5.从探索血管生成、新生淋巴管介导的肿瘤转移机制为切入点，建立有效的抗
血管生成和阻碍新生淋巴管措施，阐明肿瘤新生血管、淋巴管组成部分参与局部免疫调节的机理及建立可能的干预手段。

6.新型研究平台及模式生物学的应用，结合新的分子抑制剂筛选或合成，强调
整体和体内功能效应验证是本项目的独特之处。

(四) 可行性分析
本项目重点放在研究肿瘤细胞恶性生物行为和肿瘤转移分子干预，实现遏制肿瘤侵袭和转移的战略目标。

项目总体方案切实可行，首先，在人才队伍方面，承担本项目研究工作的中坚力量和骨干分别是我国肿瘤生物学、细胞生物学、分子生物学、肿瘤免疫学、分子药理学等领域的青年一代学科带头人和技术骨干。

本研究队伍主要以中、青年科学家组成，有6名国家杰出青年基金获得者，研究成绩斐然（项目成员发表SCI文章560篇，总影响因子共为1400，SCI引用率超过10000次)，通过前一个“973”计划的执行，已取得阶段性进展，为该项目打下坚实基础，也是确保项目顺利实施和取得成功的最基本和最重要的要素。

其次，本项目提出的主要科学问题和完成的研究目标都具有理论和实际依据，我们已经发现了一些与肿瘤增殖与转移相关的新基因、信号分子和相应阻遏剂，所建立的相关实验细胞库、组织库和动物模型库日趋完备，有可能成为研究抗肿瘤侵袭和转移的新的突破口。

第三，本项目整合了多个国家重点实验室的科研资源，包括
分子肿瘤学国家重点实验室、癌基因和相关基因国家重点实验室、生物膜与膜生物工程国家重点实验室、蛋白质组学国家重点实验室以及教育部重点学科相关实验室，通过资源和技术共享、人员交流等前期合作的可取模式，将为研究目标的实现提供有力保障。

（五）课题设计思路、各课题之间的联系及与项目总体目标的关系
根据上述研究思路，本项目设置八个相对独立又有密切关联的课题：
(1)细胞周期调控异常与肿瘤恶性增殖、侵袭相关分子机理：
主要研究内容：
A．抑癌基因p53介导的ncRNA在细胞周期检测点中的功能和分子机制ncRNA是非编码蛋白质RNA的总称，是基因组中极其重要的一部分，哺乳动物基因组中大约有将近98％的序列都由非编码蛋白的RNA基因组成。

ncRNA 在细胞调控的各个重要生物学过程中发挥作用，包括转录调节，剪切加工，调节RNA稳定性等。

大量研究证明，ncRNA与肿瘤的发生发展密切相关。

我们最新研究发现，ncRNA在细胞DNA损伤后，参与细胞周期检测点调控，这些ncRNA 的表达受肿瘤抑癌基因p53的调节。

我们将重点探讨ncRNA与细胞周期素依赖激酶复合物的相互作用，从时空和亚细胞定位的层面阐明ncRNA对这些细胞周期调控关键元件的活性影响和调控方式。

重点研究p53对重要ncRNA调控的功能和ncRNA在细胞周期检测点中形成的作用和分子机制，研究这些ncRNA表达异常导致细胞周期监控系统破坏并继发细胞失控性增殖的分子机制。

B．肿瘤抑癌基因BRCA1调控的信号通路在中心体复制过程中的作用
细胞中心体异常和染色体畸形是恶性肿瘤侵袭性生长的生物学基础之一。

BRCA1基因突变和基因敲除导致细胞中心体异常，形成自发肿瘤并进而出现肿瘤浸润性生长和转移。

我们目前发现BRCA1及其调控的Gadd45蛋白都定位在中心体上，BRCA1-Gadd45信号通路和中心体复制相关的激酶Aurora-A，Cdc2 以及Plk1有直接的相互作用。

因此，我们重点研究BRCA1-Gadd45信号通路在中心体复制过程中的生物学功能，探讨BRCA1相互作用蛋白参与中心体复制调控的分子机制以及中心体复制异常导致染色体畸形、基因组紊乱、细胞恶性增殖的分子机理；分析Gadd45蛋白与几种重要的中心体复制相关激酶（如Aurora-A，Cdc2和Plk1）的相互作用及蛋白相互作用的方式；通过细胞和动物模型，研究BRCA1-Gadd45通路异常引起的肿瘤发生和侵袭转移的联系及其相关分子机制。

C．细胞周期调控蛋白Aurora-A介导的信号通路在肿瘤侵袭转移中的作用细胞周期调控蛋白Aurora-A具有调节中心体分离、成熟以及纺锤体装配的功能，在调节细胞周期检测点中发挥重要作用。

Aurora-A异常表达在中心体扩增、染色体畸形、细胞转化和肿瘤形成中有重要作用。

最近发现Aurora-A蛋白过表达与临床人类肿瘤的恶性表型密切相关，并通过与Wnt信号通路的相互作用发挥致癌生物学作用。

我们将重点研究Aurora-A对Wnt信号通路的调控功能，包括确定Aurora-A与Wnt通路重要分子β-catenin的相互作用，Aurora-A对β-catenin的磷酸化及其对β-catenin亚细胞定位，稳定性和转录功能的影响，在细胞和动物研究模型中，阐明Aurora-A的癌基因功能和引起肿瘤侵袭转移的分子机制。

目标：揭示细胞增殖失调与肿瘤侵袭转移的内在联系。

承担单位：中国医学科学院、中南大学湘雅医学院
(2)细胞凋亡和分化异常与肿瘤侵袭性生长的关系：
主要研究内容：
A．细胞死亡新机制的研究
我们前期的研究提出了Bax/Bak缺失情况下细胞凋亡的新机制，很可能Bcl2构象变化可能使该分子从抑制凋亡的分子变成促进凋亡的分子。

我们将进一步证
实这一现象，分析在促凋亡机制缺失情况下细胞死亡的新机理，特别是采用化学生物性方法分析细胞凋亡的新机制。

B．肿瘤转移相关信号通路与肿瘤细胞凋亡的调控
TGF-β信号通路的异常在肿瘤发生和转移中有非常重要的作用。

我们将研究与肿瘤转移相关信号通路调控细胞凋亡的分子机制，分析相关信号分子在肿瘤细胞中表达情况，探索抑制肿瘤转移的新靶点。

C．肿瘤干细胞凋亡的研究
肿瘤干细胞在肿瘤发生中有重要作用。

我们最近建立了肿瘤干细胞系。

这些细胞具有干细胞的所有特征，单个肿瘤细胞能形成克隆，并在裸鼠体内形成肿瘤。

我们将筛选和分析能有效杀伤肿瘤干细胞的小分子化合物，深入分析肿瘤干细胞的凋亡机制，找到有效杀伤肿瘤干细胞的化合物。

D．信号转导和细胞凋亡调控规律的研究
机体细胞数量的稳定取决于体内细胞增殖和细胞死亡的动态平衡。

我们最新的实验数据显示蛋白hSA V1可同时抑制细胞增殖和促进细胞凋亡，除此之外我们通过酵母双杂交技术发现了一系列与hSA V1相互作用的蛋白。

我们将以hSA V1蛋白为核心，通过研究这一系列蛋白与hSA V1之间的相互作用来阐述其调节细胞增殖和细胞凋亡的信号转导机制，从而补充和完善人体细胞调节细胞增殖和细胞凋亡的信号转导机制的研究，并为包括肿瘤在内的许多增殖性疾病的生物治疗提供了新的靶点。

E．基于肿瘤细胞周期调控理论的、立足于调节亚基干预的肿瘤治疗研究Rb基因是控制细胞生长及分化最关键的基因之一，其处于细胞周期调控的中心环节；磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）参与并产生酯类第二信使，激活细胞内大量酶联级反应，在肿瘤的发生发展和侵袭中起着重要作用。

我们前期研究发现了PI3K分子中55 KDa的调节亚基以其末端的24个氨基酸（N24）和Rb相互作用，并直接影响Rb磷酸化，从而调控细胞分裂。

本课题将深入研究p55PIK的功能，探讨其在细胞周期调控中的作用，阐明其在肿瘤发生发展和侵袭中的功能，并针对p55PIK开展有效的分子干预肿瘤发生，将为肿瘤的分子靶向治疗开辟新的方向。

目标：通过了解细胞死亡的机制和细胞信号转导，深入探讨肿瘤发生的机制，
同时为有效杀伤肿瘤细胞提供理论基础。

承担单位：中国科学院动物研究所、华中科技大学
(3)肿瘤干细胞和肿瘤微环境与肿瘤转移的内在关系：
主要研究内容：
A．肿瘤干细胞相关研究
现代肿瘤干细胞假说认为这些具有自我更新能力的干细胞赋予肿瘤无限生长和自我更新的能力，但肿瘤干细胞的临床意义目前仍不明确，其生物学发生、与肿瘤转移是否有关等问题尚存在较大争议。

与实体瘤相比，白血病干细胞的表型相对较为清楚。

因此，白血病干细胞的研究一直处于前沿，其研究结果和方法对于我们认识其它类型肿瘤干细胞生物学特性及其临床意义有很大价值。

所以本课题组将以血液系统恶性肿瘤干细胞、特别是白血病干细胞为切入点，针对肿瘤干细胞研究领域亟待解决的问题，如：肿瘤干细胞的特异表型以及临床相关性；与正常干细胞比较，肿瘤干细胞特异的细胞生物学和分子生物学性质；恶性肿瘤干细胞与微环境间的相互作用机制；肿瘤干细胞与肿瘤转移的关系；特异性杀伤恶性肿瘤干细胞的方法等，着重进行下列几方面的研究：1）进一步明确胚胎干细胞和成体干细胞自我更新与迁移相关的基因在人白血病干细胞中的表达水平、细胞内分布以及和其他分子的相互作用影响；2）着重对那些在白血病干细胞中具有特异表达的分子进行功能干预试验；3）白血病微环境对白血病干细胞形成与转移的作用机制；4）将上述相关研究成果通过与其它参加单位合作扩展至实体瘤。

通过上述几方面的研究，将从干细胞自我更新的角度为寻找具有能够特异消灭白血病干细胞方法提供必要的理论基础，无疑也将对其它肿瘤干细胞研究具有重要指导意义。

同时，本课题组在前期以肝癌为研究对象，已经开展了实体肿瘤干细胞的研究，熟练掌握了肝癌干细胞研究的关键技术，如用业内公认的磁式分选和流式分选技术，获得了部分候选肝癌干细胞分子标志物cDNA克隆如CD133，DLK1、EpCAM等。

在此基础上，将通过以下几个方面的研究对实体瘤中干细胞进行深入研究：1）原发性肝癌（HCC）及转移性肝癌中肿瘤干细胞微环境异同；2）肿瘤干细胞在肝癌转移、复发中的作用；3）肿瘤干细胞niche与肝癌转移之间的关系；4）肝癌干细胞CD133以外的特异性分子标志物筛选；5）HCC组织中干
细胞分离及特性研究。

B．肿瘤局部微环境变化与侵袭转移
除上述肿瘤干细胞与微环境的关系探讨外，本研究前期还证明了质子泵（V-ATPase）通过调控肿瘤细胞的泌酸能力而影响肿瘤转移，并对其作用机制进行了探讨。

今后的研究将聚焦于肿瘤酸性微环境和肿瘤微环境中的分泌性蛋白家族新成员和基质蛋白家族新成员在肿瘤和肿瘤转移中的作用，系统研究肿瘤转移过程中V-ATPase产生的肿瘤酸性微环境对蛋白酶MMPs等的诱导和活性调控机制；深入研究分泌型蛋白家族新成员DKK1和基质蛋白家族新成员CTHRC1在肿瘤微环境中与肿瘤转移相关的新功能。

研究内容主要包括：1）靶向肿瘤酸性微环境的抗肿瘤和抗肿瘤转移新策略；2）肿瘤微环境中DKK1等分泌型蛋白家族新成员和CTHRC1等基质蛋白家族新成员在肿瘤和肿瘤转移中的作用。

目标：明确肿瘤干细胞特异的细胞生物学和分子生物学性质；恶性肿瘤干细胞与微环境间的相互作用机制；肿瘤干细胞与肿瘤转移的关系；特异性杀伤恶性肿瘤干细胞的方法等，并从肿瘤微环境的角度研究抗肿瘤转移的新策略。

承担单位：上海交通大学、中国医学科学院
(4)肿瘤血管、淋巴管生成与肿瘤转移：
主要研究内容：
A. PF4-CXCR3B相互作用与恶性肿瘤转移的研究
血小板因子-4（platelet factor-4，PF4）结合人微血管内皮细胞表面的受体CXCR3B，在体内、体外均具有抑制内皮细胞增殖和迁移及血管增生的作用，是作用最强的抑制血管增生的趋化因子。

CXCR3B只比CXCR3A在N端多出51个氨基酸，但两者作用却截然相反，说明这51个氨基酸具有重要作用。

拟重点研究PF4与CXCR3-B的相互作用、CXCR3－B分子N端ELR序列的意义及相关的信号转导通路，阐明PF4抑制细胞增殖的作用机理，并在实验动物模型中评价抗CXCR3-B单抗的抑制效应。

B. 肿瘤血管相关基因表达谱及特异膜蛋白靶分子的研究
主要研究内容包括：1）肿瘤血管内皮与正常血管内皮表型、功能及血管形成的比较和鉴定；2）建立大容量肿瘤血管内皮功能性单抗库（>4000个克隆），体内外筛选、鉴定特异识别肿瘤血管内皮的功能性膜蛋白单抗和抗原；3）肿瘤。