农杆菌介导法讲解

因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人 们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的 感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过 细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来， 农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也 得到了广泛应用。
的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类 胭脂碱(nopaline)类 农杆碱（agropine） 类。
Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应 基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达， 它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分 解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源 和碳源。
1981年，Ooms et al.发现Ti质粒上有致瘤区(virulence region)，Vir区。
Ti质粒
Ti质粒是根癌农杆菌 细胞核外存在的一种 环状双链DNA分子，长 度约200kb，平均周长 54.1－75 .4 um，分 子质量为（90－150） ×106 Da。在温度低 于30℃的 条件下，Ti 质粒可稳定地存在于 根癌农杆菌细胞内。
Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤 外， 还具有以下几种重要功能：
赋予根癌农杆菌附着于植物细胞的能力； 赋予根癌农杆菌分解代谢冠瘿碱的能力； 根癌农杆菌的寄主植物范围； 决定所诱导的冠瘿形态和冠瘿碱的成分； 参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂素 的代谢活.
1) Ti质粒的结构 来自于不同野生型根癌农杆菌的Ti质粒可根据其产生
长度：160-250 kb 6大功能区： 1)致癌区，这个区主要合成植物
生长素和细胞分裂素； 2)冠瘿碱合成区； 3)冠瘿碱分解区； 4)Ti质粒接合转移区(tra)； 5)毒性区（Vir）； 6)DNA复制区（Rep）。
T-DNA
在致癌区和冠瘿碱合成区的两侧 存在着一个24 bp直接重复序列， 由这三部分所构成的DNA区域叫 做T-DNA， 插入植物染色体中的Ti质粒片段 只有T-DNA。 由于T-DNA插入植物细胞染色体 中的位置不相同的，因此植物染 色体上可能并没有可供T-DNA插 入的专一性DNA序列。
T-DNA 区域中的这些基 因 只 有 在 T-DNA 插 入 到 植物基因组后才能激活 表达. 植物生长素和细胞分裂 素,可调节植物细胞的 生长和发育,它们的过 量表达刺激植物细胞大 量快速增长而形成冠瘿。
冠瘿碱也是在细胞内合 并成分泌出来的,构成 根癌农杆菌生长所须的 碳源和氮源.
Vir区
Vir区（Vir-region），即毒性区，其长度约为35kb。 它们控制根癌农杆菌附着于植物细胞和Ti质粒进入细 胞 有 关 部 位 ， 与 感 染 后 冠 瘿 形 成 有 关 。 Vir 区 位 于 T-
脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中 T-DNA的左右两侧是一段24bp 的重复序列,构成T-DNA的边 界序列(border sequence), 分别称为左边界(left border,LB)和右边界(right border,RB).在某些章鱼碱型 根癌农根癌农杆菌Ti质粒中 T-DNA是以两个分开的独立片 段形式存在，即T-DNA左边区 段和T-DNA右边区段。研究表 明，插入在T-DNA边界序列之 间的任何DNA都可被转到植物 染色体中。因此Ti质粒可用 做外源目的基因的载体。
1974年，Zaenen et al, Schell, Van Larebeke et al. 从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒 (tumor inducing plasmid)，称为Ti质粒。 Ti=TIP
1977年，Chilton et al.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存 在外源的DNA ,与Ti质粒的DNA有同源性，是整 合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段， T- DNA (transferred DNA),其内有致瘤和冠瘿 碱合成酶等基因。
DNA 区 左 侧 ， 包 含 义 个 毒 性 遗 传 点 （ virA 、 vir Ｂ 、 virC、 virＤ、virＥ和virG）。
vir基因的控制着Ｔ－ＤＮＡ的转移。
virＥ virＤ virC virG virＢ virA
植物细胞受伤后，细胞壁破 裂，分泌物中含有高浓度的 创伤诱导分子（酚类化合 物）：如乙酰丁酮 （acetosyringone，AS）和 α-羟基酰丁香酮（αhydroxacetosyringone，OHAS）。 根癌农杆菌对这一类物质具 有趋化性，在植物细胞表面 附着后，受这些创伤诱导分
农杆菌介导转化法
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤 部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
农杆菌 感染柳树
产生 冠瘿瘤
原理： 根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和
Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口 进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。
Story 冠瘿瘤病：双子叶植物经常发生，因肿瘤着生地面在近地面
的根茎交界处，形似帽状而得名。 1907年， Smith & Townsent 农杆菌诱发冠瘿瘤病。 1947年， Braun et al. 证实俩百度文库的关系，但发现有的菌株不
致病。提出了假说：tumour-inducing principle,TIP.肿瘤 诱导因子 。 60’s , 肿瘤组织中含高浓度的氨基酸（octopine , nopaline） 总称冠瘿碱（opine) 。 Petit et al.证实肿瘤组织 合成的冠瘿碱取决于菌株，而且菌株能专一地利用 冠瘿碱作为菌株生存的唯一的碳源和氮源。(证实了TIP)
子的刺激，Ti质粒vir区毒性
基因被激活和表达。
目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。 其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰丁 香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没食 子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟基 苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。