引物设计原则

引物设计
一、软件使用：
l 推荐软件：Primer Premier 5.0
l 优点：操作简单、显示各种参数改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等 l 缺点：没有明显缺点
l 本地同类软件：DNAClub ；Oligo 6.22；Vector NTI Suit ；Dnasis ；Omiga ；Dnastar ；DNAMAN (Lynnon
Biosoft, Quebec, Canada).
l 网上同类软件：Primer3（Whitehead Institute 开发）；JaMBW （European Molecular Biology
Laboratory of Heidelberg 开发）。

http://210.72.11.60网站已引进并调试好这两种软件。

独特之处在于：对全基因组PCR 的引物设计，可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除引发错配的引物。

因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用。

二、推荐操作：
l 引物搜索：Primer Premier 5.0 l 引物评价：Oligo 6.22
三、引物设计的原则:
首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA 聚合反应（即错配）。

围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length ）、产物长度（product length ）、序列Tm 值(melting temperature)、ΔG 值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin ）、错误引发位点（false priming site ）、引物及产物GC 含量（composition ），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。

以使用Oligo 软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：
1.
引物的长度一般为15-30bp ，常用的是18-27bp ，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74
℃，即Taq 酶的最适温度。

2. 引物3’端的序列要比5’端重要。

引物3’端的碱基一般不用A （3’端碱基序列最好是G 、C 、CG 、GC ），因为A 在错误引发位点的引发效率相对比较高。

另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能
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导致PCR 反应失败。

5’端序列对PCR 影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

3.
引物的GC 含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应。

有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC 含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。

如果G-C 比例超出，则在引物的5’端增加As 或Ts ；而如果A-T 比例过高，则同样在5’端增加Gs 或Cs 。

但也有认为：原来普遍认为PCR 引物应当有50%的GC/A T 比率的观点其实是不对的，以人基因组DNA 为模板，用81%A T 的引物可以产生单一的、专一的、长250 bp ，含有70% A T 的产物。

完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR 引物的GC/AT 比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT 比。

4.
引物所对应模板序列的Tm 值最好在72℃左右。

（Tm 值曲线以选取72 度附近为佳，5’到3’的
下降形状也有利于引物引发聚合反应），至少要在55－80℃之间 5.
ΔG 值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。

一般情况下，引物的ΔG 值最好呈正弦曲线形
状，即5’端和中间ΔG 值较高，而3’端ΔG 值相对较低，且不要超过9（ΔG 值为负值，这里取绝对
值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。

3′末端双链的ΔG 是0～－2 kcal/mol 时，PCR
产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%、到－8时少于20%、
而－10时接近于0。

6.
可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，
错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。

但对于特定的模板序列，
还应结合比较其在正确位点的引发效率。

如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以
上，而在错误位点的引发效率为130，并且不好找其他更合适的引物，那么这对引物也是可以接受
的。

7.
Frq 曲线为Oligo6新引进的一个指标，揭示了序列片断存在的重复机率大小。

选取引物时，宜选用
Frq 值相对较低的片断。

8.
引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度
从而导致PCR 正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG 或
CCC 会导致错误引发。

二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。

与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。

虽然有些带有发夹环，其ΔG 为－3 kcal/mol 的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。

当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。

9.
以公式(4×G/C + 2×A/T –5)计算Tm 值，即退火温度。

选择较低Tm 值的引物的退火温度为反应的退火温度。

4-6℃的差别似乎对PCR 产量影响不大。

最好，保证每个引物的Tm 值相匹配，且在70-75
℃范围内
10.
要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。

差异越小，PCR 的效率
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越高。

因为DNA 的解链温度也取决于它的长度，所以有的研究者喜欢设计很长，而不求它很稳定的引物。

可是，引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补，因此，一般还是不用为好。

如果期待的产物长度等于或小于500 bp ，选用短的(16～18 mer)的引物：若产物长5 kb ，则用24 mer 的引物。

有人用20～23 mer 引物得到40 kb 的产物。

11.
在DNA 测序和PCR 中最好用5′末端稳定(如GC 含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT 含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。

这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。

其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA 合成，所以不会产生假产物。

因此，为了有效地引发反应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA 也形成双链。

与此相反，带有稳定的、GC 丰富的3′
末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的
牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。

无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性
小于－9 kcal/mol 的，通常就是专一性的探针或引物。

寡核苷酸3′末端越不稳定，假引发的可能性
越低。

12.
如果用3′末端低稳定性的引物，反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。

这就可以不经过事先的最
佳化实验就能在最佳条件下进行反应。

13.
引物的唯一性：为了放大单个的、专一性DNA 片段，选用的引物序列就应当是唯一的，即在模板
中没有重复序列。

如果用哺乳动物基因组序列作为模板，可以用Alu 序列或其他短重复元件来核对想用的引物的互补性。

由此也可知，应当避免使用同寡聚物(如—AAAAAA —)和二核苷酸重复(如
—A TATA T —)。

14.
引物和产物的Tm 值不要相差太大，20摄氏度范围内较好。

定下引物的Tm 值范围之后即可定下引物
的长度范围。

15.
对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰
的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。

16.
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。

有的模板本身条件较差，比如GC 含量偏高或偏低，
导致找不到各种指标都十分合适的引物；有时PCR 产物要作为克隆对象插入到载体中表达，因此
PCR 引物设计的可选择度很低。

遇到这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件，这时，使用自
动搜索引物及正确地评价引物可使研究人员对实验心中有数。

17.
在设计克隆PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低，这种PCR 需要灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。

18. 如扩增出多条带（引发错配所致），不出目的带或出目的带很弱（引物引发效率低下）
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四、Oligo 6.22使用技巧
1. Oligo 的主要功能集中在Analyze 菜单里，只要把它弄懂了，其他的就很简单了
2.
Frq 为6.22的新功能，为邻近6－7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。

该频率高则可增加错误引发的可能性
3.
因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade 排列方式不太方便，可从windows 菜单改为tili 方式
4.
当结束检测，按Alt+P 键就出来PCR 窗口，其中总结性地给出该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。

五、ΔG 概念：
用于估测可能形成DNA 或RNA 双链的稳定性：在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。

在热动力学中，这样的性质以双链形成时的自由能(ΔG)来表示。

现在大多采用 Breslauer 等人提出的以最接近的相邻核苷酸的动力学数值(自由能)来预测双链稳定性的方法。

为简化起见，所有的计算都在25 ℃条件下进行。

此时，最接近的相邻核苷酸的自由能是：
第一个(5′)核苷酸
第二个核苷酸
dA
dC
dG
dT
dA －1.9 －1.3 －1.6 －1.5 dC
－1.9 －3.1 －3.6 －1.6 dG －1.6 －3.1 －3.1 －1.3
dT
－1.0 －1.6 －1.9 －1.9
ΔG(kcal/mol)
如：双链d(ACGG ／CCGT)的ΔG 是：
ΔG(ACGG)＝ΔG(AC)＋ΔG(CG)＋ΔG(GG)＝－(1.3＋3.6＋3.1)＝－8.0 kcal/mol
此计算方法特别适用于测定其3′末端会形成双链的引物的相容性。

也可以用来计算发夹环结构的ΔG 。

不过，这时需要根据环区内核苷酸的数量添加一定的数值。

如3个核苷酸时为5.2 kcal/mol ；4个时为4.5；5个为4.4；6个是4.3；7和8个为4.1 kcal ／mo1。

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六、按照氨基酸序列设计寡核苷酸：
按照多肽的氨基酸序列来设计PCR 引物或杂交探针是最常用的实验手段，尤其是在试图“钓取”一个蛋白质的基因时。

此时要注意的问题有：
(1) 宁可用简并引物，也不用猜测的引物。

氨基酸密码子的简并性给予引物设计以可塑性，这比用猜测的密码子要好得多。

有人用1 024个简并引物得到很好的结果。

但是，应当避免在一个区域内有很高的简并性。

但也有简并性低使引物不工作的报道。

(2) 引物与模板的错配。

一般认为，所用引物与模板有15%～20%的错配，PCR 的效果还能接受。

但是，引物3′末端的错配比同样错配率的5′末端错配会引起更严重的问题。

在最后4个碱基中有2个错配的引物，其PCR 产量急剧下降。

但是，当核苷酸浓度高时，3′末端有错配的引物还能被Tag 聚合酶很好地利用。

在0.8mmol/L 时，大多数3′末端错配引物可以接受，虽然非专一产物比较多，DNA 合成的忠实性也下降。

即使在低核苷浓度下，还会有少量从错配碱基出发的合成，因此，在开始的PCR 循环中把退火时间增加到3～5分钟，比之于用标准退火时间和高浓度核苷酸能够产生质量更好的所求产物。

(3) 在用唯一性引物时，建议用0.2 mmol/L 或更低的总核苷酸浓度，因为高浓度会增加错误参入的比率。

(4) 简并寡核苷酸时，PCR 应当在比较高的引物浓度下进行，即1～3 μ mol/L 而不是0.2 μ mol/L ，因为在反应混合物中的大多数寡聚物并不是被用来引发专一的反应，而只是产生高的背景而已。

七、复杂模板的扩增体系：
所谓复杂模板，是指体系中的DNA 种类和数量较多，不能以此引物对所有的模板一一比较来计算其异位引发的可能性的情形。

此情形下与简单模板扩增相比较，还需要遵循下面一些原则以尽可能的避免异位扩增。

1. 引物3’末端的稳定性。

引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的
ΔG 。

此值的大小对扩增有较大的影响，负值大，则3’末端稳定性高，扩增效率更高，同时也更易于异位引发。

因此在复杂模板的扩增体系中，3’末端5聚体的ΔG 应大于-9.0kcal/mol 。

2. 碱基组成应尽量随机分布，避免单一碱基的聚集。

这样可避免引物在模板的单一碱基富集区引发扩
增反应。

3. 引物3’末端应尽量避免T ，相较而言，3’末端的T 对于此处的错配更为宽容。

八、测序引物设计时的注意点：
1. 对特异性的标准掌握更严格一些，也比普通PCR 引物设计时更优先考虑特异性。

因为如果在测序反应
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中，如果引物与模板在非预期位置退火并引发链延伸，会对结果对来很大的干扰甚至造成结果无法识读。

2. Tm 值适当高一些。

现在大部分测序反应均选用耐热的测序级DNA 聚合酶来催化，并采用PCR 的热循
环程序。

选用Tm 值稍高一些，甚至退火温度接近酶的最佳延伸温度的引物，有助于使反应顺利跨过待测模板的二级结构区，也有助于降低非特异反应。

九、关于引物5’端引入限制性内切酶位点：
自从发现 Taq 酶具有非模板依赖的在新生成DNA 链的3’末端加上一个A 的特性以来，在引物5’端引入酶切位点从而方便后续克隆步骤的方法的应用大大减少，取而代之的是利用带T 载体的粘端连接来包装PCR 产物。

若实验需要在引物5’端引入相关酶切位点时，除了需要清楚所选用的酶的识别序列之外，还需要了解此酶是否有位点优势效应，即酶的活性是否因为识别位点在序列的不同位置而不同，并根据此点来选择5’末端的保护碱基。

此外保护碱基的另外一个作用就是保护酶切位点不被Taq 酶具有的微弱的5’→3’外切酶活性破坏。

十、简并引物的设计：
l 概念：简并引物的出现是出于遗传密码的简并性。

有时需要根据一段氨基酸的保守序列反推到DNA 水
平设计引物。

众所周知，大多数氨基酸（二十种常见结构氨基酸中的十八种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，就遇到部分碱基的不确定性。

这种不确定性因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的，甚至植物线粒体与无脊椎动物线粒体以及无脊椎动物线粒体的遗传密码都不尽相同。

Premier 可以针对各种不同的遗传密码规律设定不同的DNA 和氨基酸的相互转换，这取决于被分析序列的出处。

这样设计出来的引物实际上是多种序列的混和物，在某些位点有所变化，但大部分还是相同的，称之为简并引物。

Primier 软件给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear ），无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion ），支原体（Mycoplasma ），植物线粒体（Plant Mitochondrion ），原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion ），一般标准（Standard ），脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion ），和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion ）。

l 概念：简并引物是根据某些特定的目的而选用的一组混合物，指在寡核甘酸的某一位置（一个简并位）
上有多个碱基存在于不同的寡核甘酸分子中，如一组简并引物中有N1，N2，N3三个简并位，在N1上有三个碱基简并，N2二个，N3 四个，则此简并引物中共有3*2*4=24种寡核甘酸分子。

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l 简并引物常用的几个方面：
（1）从已知蛋白到相关核酸分子的研究；（2）用一组引物扩增一类分子。

l 在上述两个主要应用中，需要注意的几个主要问题：
u 从蛋白到核酸，应注意：
1) 尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物设计区。

如蛋氨酸和色氨酸均只有一个密码子。

2) 充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并
性。

3) 引物不要终止于简并碱基，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物3’末端不要位于密码
子的第三位。

4) 在简并度高的位置，可用次黄嘌呤（dI ）代替简并碱基。

5) 以上几点，遵循的总的原则为：尽量降低引物的简并度，尤其在3’末端或近3’末端。

u 用一对简并引物扩增一类DNA 分子时，同样遵循上述总的原则，即尽量降低引物的简并度，尤
其在3’末端或近3’末端。

在此种应用中，应先利用工具软件（多序列对准比较软件）或其它工具找到这些分子的保守区，然后根据共有序列，应用上面所述的一些原则来设计所需要的引物。

Degenerate Primers
For amplification of cognate sequences from different organisms , or for "evolutionary PCR", one may increase the chances of getting product by designing "degenerate" primers: these would in fact be a set of primers which have a number of options at several positions in the sequence so as to allow annealing to and amplification of a variety of related sequences . For example, Compton (1990) describes using 14-mer primer sets with 4 and 5 degeneracies as forward and reverse primers, respectively, for the amplification of glycoprotein B (gB) from related herpesviruses. The reverse primer sequence was as follows: TCGAATTCNCCYAAYTGNCCNT
where Y = T + C, and N = A + G + C + T, and the 8-base 5'-terminal extension comprises a Eco RI site (underlined) and flanking spacer to ensure the restriction enzyme can cut the product (the New England Biolabs catalogue gives a good list of which enzymes require how long a flanking sequence in order to cut stub ends). Degeneracies obviously reduce the specificity of the primer(s), meaning mismatch opportunities are greater, and background noise increases; also, increased degeneracy means concentration of the individual primers decreases; thus, greater than 512-fold degeneracy should be avoided. However, I have used primers with as high as 256- and 1024-fold degeneracy for the successful amplification and subsequent direct sequencing of a wide range of Mastreviruses against a background of maize genomic DNA (Rybicki and Hughes, 1990).
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Primer sequences were derived from multiple sequence alignments; the mismatch positions were used as 4-base degeneracies for the primers (shown as stars; 5 in F and 4 in R), as shown above. Despite their degeneracy, the primers could be used to amplify a 250 bp sequence from viruses differing in sequence by as much as 50% over the target sequence, and 60% overall. They could also be used to very sensitively detect the presence of Maize streak virus DNA against a background of maize genomic DNA, at dilutions as low as 1/109 infected sap / healthy sap (see below).
Some groups use deoxyinosine (dI) at degenerate positions rather than use mixed oligos: this base-pairs with any other base, effectively giving a four-fold degeneracy at any postion in the oligo where it is present. This
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lessens problems to do with depletion of specific single oligos in a highly degenerate mixture, but may result in too high a degeneracy where there are 4 or more dIs in an oligo.
十一、克隆PCR 引物的设计
General guidelines on the primer design for PCR cloning
1. Complementary sequence of 18-20 bases is sufficient in most cases if you don't bother to calculate Tm
(see links below if you want to calculate Tm).
2. If your protein is not fused to anything, you should add a start codon (ATG) immediately in front of
your gene in the forward primer, and the complement of a stop codon (TAA/TGA/TAG - TAA is preferred) immediately after in your reverse primer.
3. Introduce one or more restriction sites depending on how you wish to ligate the gene into the expression
vector - e.g. if you use pET 21b, use Nde I (conveniently containing the start codon) for the forward primer, and Xho I for the reverse primer if you wish to fuse the protein to a C-terminal His-tag. Make sure that the restriction sites chosen are absent in the gene.
4. Put in extra bases at the 5'end to allow for efficient digest by restriction enzymes - consult NEB catalog .
8-10 are more than sufficient in most if not all cases (it's actually a bit of overkill as 3-4 are suitable for most). These extra bases are unnecessary if you are doing TA cloning. 5. Two or more of these extra bases can form a GC clamp at the 5'end. 6. Avoid too many G or C at the 3'end. 7. Avoid long runs of single nucleotide.
8. Make sure the forward and reverse primer don't form primer dimer (esp. no complementary sequences
at the 3' end) or form significant secondary structure. See Alkami Biosystem Primer Design online for primer design sites.
9. It may be useful (though normally unnecessary) to check sequences of gene or vector for homology of
70% or more with the primer to avoid multiple PCR products.
The above guidelines should be sufficient in most cases, but if you'd like more details, see tips on primer design , notes on primer design , Tavi's PCR guide , and Primer design workshop . There are also a number of web-sites for primer design at Alkami Biosystems and at BioGuide .
Example
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N can be any of the 4 nucleotides, therefore Forward oligo 5' GGCGCAATACATATGAGAGACAGTGGGACCGTCTG 3'
Reverse oligo
5' GGCCGAACTCGAGTTACTCTAGAATCCTCAAGTCCA 3' (sequence complement to the sense strand) Note:
1) If the N-terminus of your protein is not fused to any fusion partner or peptide, it is often useful to change wherever possible G or C to A or T for the first few codon. This will help reduce secondary structure on the translation initiation site and therefore improve expression. 2) Although we need not consider designing degenerate primer, but should the need arise, see degenerate PCR
for guidance.
十二、巢式PCR 引物
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This gel photo shows the effect of nested PCR amplification on the detectability of Chicken anaemia virus (CAV) DNA in a dilution series: the PCR1 just detects 1000 template molecules; PCR2 amplifies 1 template molecule (Soin?C, Watson SK, Rybicki EP, Lucio B, Nordgren RM, Parrish CR, Schat KA (1993) Avian Dis 37: 467-476).
十三、cDNA PCR
A very useful primer for cDNA synthesis and cDNA PCR comes from a sequencing strategy described by Thweatt et al . (1990): this utilised a mixture of three 21-mer primers consisting of 20 T residues with 3'-terminal A, G or C, respectively , to sequence inside the poly(A) region of cDNA clones of mRNA from eukaryotic origin. I have used it to amplify discrete bands from a variety of poly(A)+ virus RNAs, with only a single specific degenerate primer upstream: the T-primer may anneal anywhere in the poly(A) region, but only molecules which anneal at the beginning of the poly(A) tail, and whose 3'-most base is complementary to the base next to the beginning of the tail , will be extended.
eg: 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(A,G,C)-3'
works for amplification of Potyvirus RNA, and eukaryotic mRNA
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十四、PCR 部分注意事项
l A more rigorous treatment of Ta is given by Rychlik et al . (1990): they maintain that if the Ta is
increased by 1o C every other cycle, specificity of amplification and yield of products <1kb in length are both increased.
Plasmid and biopsy sample DNA templates were amplified at different annealing temperatures as shown: note that while plasmid is amplified from 37 to 55o C,
HPV DNA is only specifically amplified at 50o C.
l Primer concentrations should not go above 1uM unless there is a high degree of degeneracy; 0.2uM is
sufficient for homologous primers.
l Nucleotide concentration need not be above 50uM each: long products may require more, however.
十五、Helix Destabilisers / Additives
With NAs of high (G+C) content, it may be necessary to use harsher denaturation conditions. For example, one may incorporate up to 10% (w or v/v) :
• dimethyl sulphoxide (DMSO), • dimethyl formamide (DMF), • urea
•
or formamide
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in the reaction mix: these additives are presumed to lower the Tm of the target NA , although DMSO at 10% and higher is known to decrease the activity of Taq by up to 50% (Innis and Gelfand, 1990; Gelfand and White, 1990).
Additives may also be necessary in the amplification of long target sequences: DMSO often helps in amplifying products of >1kb. Formamide can apparently dramatically improve the specificity of PCR (Sarkar et al ., 1990), while glycerol improves the amplification of high (G+C) templates (Smith et al ., 1990).
Polyethylene glycol (PEG) may be a useful additive when DNA template concentration is very low: it promotes macromolecular association by solvent exclusion, meaning the pol can find the DNA
十六、链接
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