药物的含量测定方法与验证

四、检测限（ limit of detection， LOD)
是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限 度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的 浓度或量即可。
1.目视法 用含已知浓度被测物的试样进行分析，目视确 定能被可靠地检测出的被测物的最低浓度或量，常用于显 色鉴别法，TLC 2.当用GC和HPLC法时，一般以S/N＝2或3时的相应浓度来 确定检测限。
一、准确度（accuracy）：
测量值与真实值接近的程度
表 示: 回收率 测定方法：
回收试验
加样回收试验
测得量 回收率％＝ 100 ％ 加入量
测 得 量 本 底 量 回收率％＝ 100 ％ 加入量
含量测定方法的准确度
1. 原料药：可用已知纯度对照品或供试品进行测定； 或与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较 2. 制剂：考察其他组分和辅料对回收率的影响 ①用含已知量被测物的制剂各组分混合物（包括制剂辅 料）进行测定，回收率计算同原料药 ②向制剂中加入已知量的被测物进行测定 ③与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较
吸光度A
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 20 40 60 80 浓度c(ug/ml) 100 120 140 160 y = 0.0047x - 0.01 R 2 = 0.9986
75
100 125 150
0.35
0.45 0.58 0.69
A
线性的偏离
……… ﹍﹍﹍
第四章
药物的含量测定方法与验证
基本内容
第一节 滴定分析法 第二节 分光光度法 第三节 色谱法 第四节 药品分析方法验证 第五节 定量分析样品的前处理方法
基本要求
一、掌握定量分析方法验证的效能指标。 二、熟悉定量分析样品的前处理方法。 三、了解定量分析样品的前处理方法的 进展及在药物分析中的应用。
1. 特点 准确度高，RSD（%）为2% -5%
仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用广范 2. 朗伯-比耳定律 吸收系数：
A = ECL
摩尔吸收系数ε —— 研究分子结构 1% 百分吸收系数Ｅ —— 含量测定 1cm
3.仪器的校正和检定
波长的校正：汞灯中的几根较强的谱线或用仪器自身 所带的氘灯的特定谱线为参照进行校正 吸收度准确性的检定：重铬酸钾的硫酸溶液，规定波 长处测定Ｅ，应符合规定 杂散光的检查：一定浓度的碘化钠和亚硝酸钠溶液， 规定波长处测定透光率，应符合规定
检测器：氢火焰离子化检测器 色谱图：30分钟内记录完毕 2. 色谱适用性实验：同HPLC 3. 测定法：同HPLC
第四节
药品分析方法验证
目的：证明采用的方法适合于相应检测要求。
起草药品质量标准 生产工艺变更
制剂组分改变
原分析方法修订
均需对分析方法进行验证
验证内容：
准确度、精密度、专属性、检测限、 定量限、线性、范围和耐用性
C
七、范围 （range）
是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法 适用的高低限度或量的区间。 如原料药和制剂含量测定：应为测试浓度的80%～120%
制剂含量均匀度检查：应为测试浓度的70%-～ 130%。
溶出度或释放度中的溶出量测定：应为限度的±20%。
八、耐用性（robustness）
是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的 承受程度。 典型的变动因素有：
被测溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。 HPLC变动因素有： 流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。 GC变动因素有： 色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。
检验项目和验证内容：
项目 杂质测定
内容
准确度 精密度 重复性 中间精密度 专属性② 检测限
鉴别
定量
＋ － ＋ ＋①
含量测定 及溶出量 限度 测定 ＋ ＋ ＋ ＋① ＋ ＋ ＋ －
① 已有重现 性验证， 不需验证 中间精密 度 ② 如一种方 法不够专 属，可用 其他分析 方法予以 补充 ③ 视具体情 况予以验 证
＋
＋ －③
定量限
线性 范围 耐用性 ＋
＋
＋ ＋ ＋
峰面积 含量
对照液（R）： AR
内标液（S）： AS
CR
CS
AS/CS f= ———— AR /CR
’ / C’ A S S f= ———— Ax /Cx
供试液（X）： AX
CX
Ax Cx=f· ———— A’S / C’S
2)外标法测定供试品中主成分含量
对照液（R）： AR 供试液（X）： AX CR CX
（V0－V）FT 含量％＝ 100％ W
第二节 分光光度法
光谱 光谱分析法 分光光度法 分类 紫外-可见分光光度法 红外分光光度法 原子吸收分光光度法 荧光分光光度法 火焰光度法
二、光谱分析法
（一）紫外-可见分光光度法 吸收光谱范围：紫外：200～400nm 可见：400～760nm 灵敏度高，可达10-4g/ml -10-7g/ml
4. 对溶剂的要求: 含杂原子的有机溶剂通常具有很强的末端吸收
它们的使用范围均不能小于截止使用波长
石英吸收池、空气为空白
λ(nm)
220～240
溶剂+吸收池A
≤ 0.40
241～250
251～300
≤ 0.20
≤ 0.10
300以上
≤ 0.05
5. 测定方法
要求供试品溶液的A应在0.3 ～0.7
aA（待测物） + bB（滴定液） a b T/M 1· m
T = m×a/b×M m：滴定液浓度 (mol/L)
cC + dD
M：被测物分子量
3.百分含量的计算 （1）直接滴定法
设至终点时，消耗滴定液体积为V ml 则药物实测质量为V· T
浓度校正因子
F＝
C实际 C规定
实测药物质量 VFT 含量＝ 100％＝ 100％ 供试品取样量 W
五、定量限（ 1imit of quantitation， LOQ)
是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结 果应具一定准确度和精密度。 杂质和降解产物进行定量测定时，要求LOQ。
常用信噪比法确定定量限。
一般以S/N=10时相应的浓度进行测定。
六、线性（linearity ）
是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度 或量直接呈正比关系的程度。
（源自文库）荧光分析法
灵敏度高，可达10-10g/ml ～ 10-12g/ml 在低浓度进行测定，防止自熄灭作用 1. 特点 用基准溶液代替对照液校正仪器灵敏度 制备荧光衍生物，可提高灵敏度和选择性 干扰因素多，需做空白实验 样品用量少，操作简单，应用范围较广
2.含量测定
原理：当激发光强度、波长、所用溶剂及温度 等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其荧 光强度R与该物质浓度C成正比
（鉴别、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性） 1.鉴别反应 应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测 组分的样品均应呈现负反应
2.含量测定和杂质测定
色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明 专属性。
图中注明各组分位置，色谱法中分离度应符合要求。 在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果 的干扰。 在杂质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法 和药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比 较两种方法。
流动相 真空脱气机 四元泵
自动进样器 柱温箱
紫外检测器
蒸发光散射检测器
质谱检测器
液质联用仪
流动相：对于以C18为固定相的反相色谱系统， 常用甲醇-水，间或加以乙腈、缓冲液等为流动 相，有机溶剂比例通常不低于5％
四元泵
自动进样器
色谱柱
填充剂常用：十八烷基硅烷键合硅胶
检测器
3. 测定方法 1)内标法加校正因子测定供试品中主成分含量
回归方程的相关系数（r）越接近1，表明线性越好
可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一 系列（至少5份）供试液进行测定，以响应值对浓度作图， 建立回归方程，求出r 如UV：制备一个标准系列，浓度点n =5 A=0.3-0.7 建立回归方程C = aA + b r ＞ 0.9999
C 50
A 0.22
重复性:
同一实验室,同一人多次测定的精密度
中间精密度:
同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度
重现性:
不同实验室，不同人测定的精密度
数据要求
均应报告标准偏差、相对标准偏差和可信限
三、专属性（specificity）:
指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存
在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性
含量测定：
药物的含量测定系指运用化学、物 理化学或生物学的方法测定药物中主要有 效成分的含量。
第一节
容量分析法
（一）容量分析法的特点：
常用于测定高含量或中含量组分，原料药含量测定首选
比较准确（相对误差＜0.2%）； 操作简单、快速；仪器普通易得；
（二）有关计算
1.滴定度（T）： 每1ml规定浓度的滴定液相当于被测物质的质量(mg) 2.滴定度的计算
方法：对照品比较法 R 供－R 供空白 计算： C供＝ C对 R 对－R 对空白
第三节 色谱法
根据混合物中各组分的色谱行为差异，先 行分离后再在线或离线对各组分逐一进行分析
的方法，是分离分析混合物的最有力手段。
按分离原理：吸附；分配；离子交换；空间排阻
分类
按分离方法：PC；TLC；柱色谱；GC；HPLC 特点：高灵敏度、 高效能、高速度、应用广泛
100
注意： E1cm 应>100
应注意仪器的校正和检定： 作为计算浓 度的因数进行定量的方法，不是任何情况下都 适用的，特别时单色光不纯的情况下，A会随 仪器不同而变化，误差较大
但若认定一台仪器，固定其工作状态和测 定条件，则C和A间的关系在多数情况下仍符合 Lambert－Beer定律
3）计算分光光度法： 方法有多种，具体按每种药物规定的方 法进行。如：VA的三点校正法 4）比色法 加入显色剂后，按照对照品比较法测定 影响显色因素很多，故需注意平行操作 空白溶剂：溶剂+显色剂，同法处理
W：供试品取样量
（2）剩余滴定法（回滴定法、返滴定法） 药物 + A（定、过量） →· · · · · · · · · · · · · · · · 剩余的 A + B →·······（回滴）· · · · · · V 空白试验· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · V0
CX CR ——＝—— AX AR
CR· AX CX＝———— AR 要求：进样量准确、操作条件稳定
（二）GC法
1. 对GC仪器一般要求 载 气：氮气 色谱柱：填充柱或毛细管柱 填充柱：内径2～4mm，长1～10m，内装吸附剂
高分子多孔小球或涂渍固定液的载体 毛细管柱：内径0.2～0.5mm，长10～100m，一般为空 心柱，内壁或载体经涂渍或交联固定液
（一）HPLC法 1. 对仪器一般要求 固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变 其他均可适当改变 色谱图20分钟内记录完毕 2. 系统适用性试验 色谱柱的理论板数：n = 5.54(tR /Wh/2)2 分离度：R = 2（tR1 – tR2)/(W1 + W2); 应大于1.5 重复性：对照液连续进样5次，峰面积RSD≤2.0％ 拖尾因子：T = W0.05h/2d1 应在0.95 ～ 1.05
具体做法： 测定高、中、低三个浓度，n=3, 共9个数据来评价回 收率；用UV和HPLC法时，一般回收率可达98%～102%； 容量法可达99.7%～100.3%
二、精密度（precision ）：
定 义: 同一样品多次测量值之间相互接近的程度
表 示：偏差，标准偏差,相对标准偏差
1. 偏差(deviation ,d) d = 测得值-平均值=Xi-X 2. 标准偏差（standard deviation,SD或S） S =[(∑Xi – X)2/(n-1)]1/2 3. 相对标准偏差(relative standard deviation,RSD) RSD=标准偏差/平均值×100%=S/X ×100%
1）对照品比较法：A供／A对＝C供／C对
实测药物质量 C X D V 原料药： 含量％＝ ＝ 100％ 供试品取样量 W
实测含量 / 片 C X D V W 标示量％＝ ＝ 100％ 制剂： 标示含量 / 片 标示量 W
W 片数＝ W
2）吸收系数法：
1％
CX
AX
E
1% 1cm