研究生酶学1

为什么酶能有效地降低反应的活化能呢？这是因为
（1）酶与底物的邻近效应（Proximity）和定向效应（Orientation）。

邻近效应是指A和B两个底物分子结合在酶分子的活性部位上，使得反应基团相互靠近，从而降
低了进入过渡态所需的能量，这种效应称为邻近效应。

邻近效应大大增加了反应物的
有效浓度。

底物有效浓度大，自然反应速度加快。

定向效应是指当底物结合在酶活性
中心时，反应基团沿一定的方向相互靠近，使反应基团的分子轨道发生交叉，进入过
渡态。

定向效应给反应基团分子轨道交叉提供了良好的条件。

这是在溶液中由于分子
随机接触而进入过渡态所不能比拟的。

（2）酶与底物相互诱导的扭曲变形（strain或distortion）以及构象变化。

我们知道过渡态分子是不稳定的，其中某些化学键是处于伸展或变形之中。

反应物要达到过
渡态的化学键状态是需要能量的。

酶活性部位与底物结合，可使底物的某些敏感键发
生变形，从而使底物分子更接近于过渡态。

底物分子的变形可能是发生在底物与酶结
合时，为了很好地契合，底物的构象有了小的变化，也可能是由于底物诱导酶改变构
象之后随之而得的一个结果。

总之，酶活性部位的某些基团或离子，使底物敏感键的
某些基团的电子云发生改变，即底物发生构象改变，形成互相契合的酶底物复合物。

（3）广义的酸碱催化，共价催化以及酶活性中心微环境的影响。

酶活性中具有相
互的催化基团，这些基团可以参与催化反应，其具体的催化机理后面章节会专门讲到
的。

此外，酶活性中心的微环境有利于特定的催化翻译能够进行。

在一个具体的酶催化反应中，上述因素往往是同时起作用，从而表现出酶催化功
能的高效性，这是一般化学催化剂所无法比拟的。

酶特异性的类型
一般来讲，一种物质能否成为某种酶的底物，必须具备两个条件，一是分子上具
有被酶作用的化学键，二是该分子应具有一个或多个结合基团与酶活性中心结合，并
使其敏感键对准酶的催化基团。

一般来说，酶的底物特异性一般可分为下列类型
（A）反应特异性（reaction specificity）：指酶只催化某一特定类型的反应，如氧
化作用（oxidation），转氨作用（transamination）等。

（B）底物特异性（substrate specificity）：指酶通常只选择性地与一组化学上相似
的分子中一种或一对分子发生有效地结合，如谷氨酸脱氨酶与氨基酸中谷氨酸有效地
结合，麦芽糖酶只作用于麦芽糖，脲酶只作用于尿素。

后两者又称绝对专一性结合（absolute specificity）
（C）立体化学特异性（stereochemical specificity或stereospecificity）如果底物分子存在多种立体异构体（stereoisomers），它们中仅一种立体构性分子能有效地与酶
活性中心结合。

如精氨酸酶只水解L-Arg，而不作用于D-Arg，乳酸脱氨酶只作用于L-乳酸。

葡萄糖代谢中的酶仅作用于D-葡萄糖残基分子。

反丁烯乙酸酶只作用于反丁
烯二酸，而不作用于顺反丁烯二酸等。

反应特异性通常是由于酶活性位点内特异催化
基团的特殊性质决定的。

底物特异性则是由酶活性位点内的接触残基和结合基团的作
用决定的。

而立体特异性则需要酶活性部位的基团与底物分子在各个位置上相互作用。

生命现象表现了其内部反应过程的有序性，这种有序性是受多方面因素调节和控
制的。

而酶活性的调控又是代谢调节作用的主要方式。

酶活性调节主要有7种方式：1）、酶浓度调节
酶浓度调节主要表现在两个方面：一是诱导或抑制酶的合成，另一是调节酶的降
解。

例如，β-半乳糖苷酶的合成，平时是处于被阻遏状态，当乳糖存在时，半乳糖苷
酶基因活化，诱导酶的合成。

另一个方面各种酶在细胞内都有一定的寿命，最后都能
被蛋白酶降解掉，酶的降解也是对酶作用的一种调节方式。

2）、信号诱导调节
当外界信号分子与细胞膜上的受体作用后，可调节细胞内的酶蛋白的合成。

比如乳糖合成酶有两个亚基：催化亚基和修饰亚基，催化亚基本身不能合成乳糖，但当它
与修饰亚基结合后，则可催化半乳糖和葡萄糖反应生成乳糖。

修饰亚基的水平则是由
激素控制的妊娠时，修饰亚基在乳腺中生成，分娩时，由于激素水平急剧地变化，修
饰亚基大量地合成，与催化亚基结合后，即合成大量的乳糖。

3）、酶活力的调节
细胞内新合成的新生酶许多是无活性的前体（即酶原）形式存在。

一旦生理需要，才通过限制性水解作用使酶原转变为具有生物活性的酶。

这个过程也称为酶原激活。

例如胰蛋白酶原在小肠里被其它蛋白水解酶作用，切除一个六肽后，活化成胰蛋白酶。

4）、共价修饰调节
共价修饰调节本身也是通过酶催化来进行的，即在一个酶分子上，共价地引入一个基团从而改变它的活性，引入的基团又可能被另一个酶催化除去。

例如磷酸化酶的
磷酸化和去磷酸化；大肠杆菌谷氨酸胺合成酶的腺苷酸化和去腺苷酸化都是以这种方
式来调节它们的活性。

5）、抑制剂的作用
酶活性可受到大分子或小分子抑制剂的抑制，从而影响酶活力。

如抑肽酶可抑制胰蛋白酶的活性，2，3-二磷酸甘油可抑制磷酸变位酶的活性。

6）、反馈作用
在许多合成反应系列中，催化第一步反应的酶活性往往可被终端产物抑制。

这种对自我合成的抑制称为反馈抑制。

这在生物合成代谢中是常见的现象。

例如，异亮氨
酸可抑制异亮氨酸合成代谢通路中的第一个酶-苏氨酸脱氢酶的活性。

当异亮氨酸的浓
度降低到一定的水平时，抑制作用解除，合成反应又重新开始。

7）、金属离子的调节作用
一些酶需要K+活化，而Na+则不能活化，有时还有抑制作用。

例如L-高丝氨酸脱氢酶，丙酮酸激酶，天门冬氨酸激酶，丙酮酸羧化酶。

另一些酶则需要Na+活化，K+起抑制作用。

如蔗糖酶。

酶蛋白有三种组成形式
单体酶（monomeric enzyme）一般是由一条多肽链组成，但有的单体酶则是多条肽链组成，如胰凝乳蛋白酶是由三条肽链组成，肽链间由二硫键相连构成一个整体。

这类含有几条肽链的单体酶往往是由一条无活性的前体多肽链（酶原）经活化断裂后形成的。

寡聚酶（oligomeric enzyme）是由两个或两个以上亚基组成的酶，这些亚基可以是相同
的，也可以是不同的。

多酶复合体（multienzyme complex）是由两个或两个以上的酶，靠非共价键连接在一起
而成。

其中每一个酶催化一个反应，所有的反应依次连接，构
成一个代谢途径或代谢途径的一部分。

由于这一串的反应是在
一个高度有序的多酶复合体内完成，所以反应效率非常高。

多酶融合体（multienzyme conjugate）是指一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性
的酶。

这往往是基因融合的产物。

它们可以是单体酶
的形式，也可以是寡聚酶或多酶复合体的形式存在。

所有的酶被分为六大类（1）氧化还原酶类，（2）转移酶类，（3）水解酶类，（4）裂合酶类，（5）异构酶类，（6）连接酶类。

活性部位的含义
从结构上看，生物大分子内与酶催化活力直接相关的一个小区域我们称之为活性部位或活
性中心。

它是酶分子中与底物结合并催化反应的场所。

活性部位是由酶分子中极少数的几个
氨基酸残基的侧链基团组成。

它们在一级结构上的位置可能相距很近，可能分别位于同一肽链或不同肽链的不同位置。

由于肽链的折叠和盘转，使得它们在空间位置上很接近，构成一个特定的活性区域结构。

就功能而言，活性中心的几个氨基酸侧链基团又可分为底物（包括辅酶，金属离子等）结合部位和催化部位。

底物结合部位是与底物特异性结合的有关部位，因此也叫做特异性决定部位。

催化部位直接参与催化，底物的敏感键在此部位被切断或形成新键，并生成产物。

底物结合部位和催化部位之分并不是绝对的，有的基团兼有结合底物和催化底物的功能。

催化部位和底物结合部位都是活性部位的组成部分，但两者的功能有所不同。

催化部位是由催化反应中直接参与电子转移的氨基酸残基组成，一般来讲，没有辅酶的
酶蛋白的催化部位，仅涉及某几个特定的氨基酸残基侧链基团。

而有辅酶的酶，由于辅酶直接参与电子转移。

当然与辅酶结合的酶蛋白的特定氨基酸残基也是不可缺少的。

另外，有些酶含有某些金属，这些金属与催化反应直接相关。

而这些金属都是通过与酶蛋白特定的氨基
酸侧链相互作用后，与底物之间进行电子转移。

不管那种情况，酶的催化部位总是要涉及几
个特定的氨基酸残基的侧链基团的。

底物结合部位每种酶都有自己独特的专一性。

只有与酶活性中心结构相适应的底物分子才
能被酶结合。

（适应是多方面的，如分子大小、形态、电荷）。

应该说底物专一性主要是由底
物结合部位决定的。

但有些催化基团也参与底物的结合。

酶与底物的特异结合是多点结合，
需要几个或更多的氨基酸残基参加（可以是残基侧链，也可以是主链骨架），而且要求这些残基在三维空间中的正确排布。

如果正确的位置受到干扰或破坏，不仅丧失识别底物和非底
物的能力，底物不能正确地结合在活性中心。

由此导致酶活性降低，乃至完全失活。

催化部位与底物结合部位的关系
虽然从功能上讲可以把活性部位分为催化部位和底物结合部位，但这两个部位并不是各自独立存在的，而是相互关联的。

作为一个酶来讲。

底物的结合部位的作用，不单单是识别，
固定底物分子，而且要求底物处于被催化的最优位置。

构成底物结合部位的氨基酸残基的空
间位置，不但要适合底物的结合，同时也要求适合于催化底物反应。

别构部位（Allosteric site）
许多酶除了活性部位之外，还有所谓的别构部位。

一般讲来别构部位是独立于活性部位
之外的另一个别构配体结合部位。

别构配体与酶底物毫无共同之处。

当一个别构配体分子与配体部位结合后，会引起酶分子构象上的变化，从而导致活性部位构象的改变。

这种改变可能增加催化能力，也可能降低催化能力。

前者称为正协同作用，后者称为负协同作用。

与活性部位的底物结合不同，别构配体与别构部位结合后，配体本身并不发生任何化学变化，只是间接地影响酶活力。

确定酶活性部位的研究方法
化学修饰法酶分子中可以被修饰的基团很多，凡是可解离的或带有极性的侧链基团如羟
基、巯基、咪唑基、氨基、羧基等都是修饰的对象。

在化学修饰法中，常常使用酶失活的特
异性来确定活性基团。

此法是以竞争性抑制保护酶活性，因为抑制剂结合的部位是活性部位，
所以在竞争性抑制剂存在下，共同标记使酶失活的程度就会远远底于无抑制剂存在时的情
况。

（1）使用非特异性试剂对特殊基团的标记如酶的活性中心含有活性部位以外没有的氨基
酸残基时，则可使用一般非特异性试剂（即不能区分活性部位内和外的基团的试剂）进行化学修饰。

（2）差示标记法这类方法是非特异性试剂标记法的发展。

此法主要是利用竞争性抑制作
用的保护效应，不要求被标记的活性基团有特殊灵敏的反应性。

（3）亲核标记法此类反应方法主要是利用酶与底物特异结合这种性质来设计标记试剂。

这类修饰剂作用于被作用部位的某一基团，而不与被作用部位以外的同类基团发生作用。

一般它们都是有与底物相似的结构，对酶活性部位具有高度的亲核性，能对活性部位的氨基酸残基进行共价标记，使酶发生不可逆的失活。

亲和试剂可以专一性地标记酶的活性部位上，
使酶发生不可逆失活。

因此也称专一性的不可逆抑制和Kcat型不可逆抑制。

（课件）
2．动力学分析法
动力学方法是研究酶活性部位的常用方法之一。

主要是研究PH对酶催化活力的影响。

首先取好反应速度的参数。

特别是V/Km对PH的依存性数据。

然后通过作图法求出催化反应必
需基团的PK值，蛋白质中各类解离基团的PK值，由于基团分布的影响往往同一基团出现
不同的PK值。

但一般而言，每一种基团大体上有一个PK范围。

通过分析比较基本上可以
从PKe值估计出基团的种类。

3．紫外吸收光谱和荧光光谱法
通常是利用蛋白质分子中本身含有的显色基团（如色氨酸），也可用化学修饰法人为的引如
生色基团，当酶与底物结合时，位于底物结合部位的生色基团必然发生某种变化。

根据这种变化，可以推断生色基团本身。

通过化学修饰法引入生色基团，能够查明生色基团周围的环境，从而推断底物结合部位的情况。

4 X-光衍射分析
如果能结晶酶，酶与底物，酶与底物类似物，酶与专一性抑制剂等复合物，然后进行
X-衍射分析直接解析酶的活性中心的结构，即可了解参与底物结合或催化反应的活性基团。

为什么要使用初始速度呢？
通常在稳态动力学（steeddestate kinetics）中，我们需要测量和处理初始速度，即时间为零
时的速度极限值。

为什么要使用初始速度呢？这主要是初速度所涉及的干扰因素少，易于处理。

反应速度只是在最初的一段时间内保持恒定，随时间的延长，反应速度逐渐降低。

反
应速度下降的原因很多，最主要的是底物浓度的降低，产物浓度的增加，从而加速了逆反应的进行，以及酶在反应条件下部分失活等。

但是，如果我们测定反应的初期，产物P的影响可以忽略，酶在极短的反应过程中也不会发生变性失活。

注意相应于处速度的底物浓度称
之为底物的初始浓度[S]。

虽然初始速度定义为反应时间为零时的极限速度，但是在实际操
作中，总是要使反应进行足够短的一段时间。

在此足够短的一段时间内，使时间进行到一个恰当的程度。

一般来讲，这是所谓的恰当的程度是指底物消耗不超过5%，。

这时即可精确地测得初速度的数据。

PH温度影响酶促反应速度
PH对酶促反应的影响是多方面的，如过酸或过碱可使酶空间构象改变，使酶遭受可逆或不
可逆的失活。

此外，PH还可以改变底物的解离状态，影响底物与酶的结合。

研究PH对酶促反应的影响最有意义的是PH能够影响酶分子上一些氨基酸侧链的解离状态。

温度对酶促反应影响是多方面的，主要有两个方面：其一是温度对酶稳定性的影响，即对酶的热变性失活作用；其二是温度对酶促反应本身的影响，其中包括酶和底物的结合，影响酶和底物分子解离基团的PK，影响酶与抑制剂、激活剂或辅酶的结合等。

因此要研究一个酶促反应，首先应该了解该酶的稳定性温度范围，在该温度范围内进行各种
实验，才能说明该酶促反应的各种特征。

确定一个酶的稳定温度范围，是将酶分别在不同温度下预保一定时间（大约为进行酶活性测定时间的1-2倍）。

然后回到较低温度（即酶的热
变性失活作用可忽略的温度），测定酶活性次数。

测出在该时间内酶活性不降低的最高温度，
即为该酶的稳定性温度。

酶稳定温度告诉我们什么呢？它仅能告诉我们对某一特定酶来说，
各种实验应在酶稳定性温度范围内进行。

但不应在此温度条件下长期保存该酶。

这是因为酶
稳定性温度仅表示在一特定的时间内，酶是稳定，并不是无限的。

一般保留酶都应在0℃以下低温保存。

当然并不是所有的酶都能在0℃以下保存的，尤其是有此酶在低温下更容易失
活。

快速平衡假说与稳态假说
假设E+S≒ES是一个快速平衡反应，ES分解成产物的反应对这个平衡反应干扰很小，
即kp《k-1，可以忽略。

当反应速度达到平衡时，正反应的速度（v1）和逆反应的速度（v2）应该相等
[ES]不一定与[E]和[ES]是平衡状态,而是在反应进行很短的时间后,[ES]即由零增加到一
定值.此时尽管ES也在不断分解和合成,但其生成和分解的速度相等.即浓度达到稳态,不再改变. 在初速度条件下,[P]很少∴它的逆反应E+P→ES可以忽略不计
Km和kcat的意义
(1) kcat为反应速度常数,也称turn over number用min-1表示.一般酶的kcat值在50—10-7
之间, kcat值越大,说明反应生成产物的效率越高,即反应速度越快,反之亦然.
(2) Km为米氏常数.当kp<<k-1值时,Km≈Kd这时可把Km值作为衡量酶与底物结合能力大小
的度量.Km值越小,说明酶与底物容易结合成酶底物复合物.反之Km值越大,酶与底物结合较弱,因此这时Km与Kd可以互用.
(3) 如果[S]<<Km时米氏方程可改写为
v/[Et]=kcat[S]/Km,这时kcat/Km是一个常数
kcat/Km称为一个速度常数或催化效率常数,表示结合的底物在单位时间内转变成产物
的量,如果一个底物具有小的Km值和大的kcat值,在酶存在的条件下,其酶促反应就会非常快.因此kcat/Km通常用来作为判断底物之间优劣的一个重要指标,以确定酶的底物特异性.
1 比活力Kcat
2 可逆抑制作用的特征，作图，判断类型，参数求解。

3 兵乓求解与顺序的区别。