分子标记技术的类型原理及应用--ppt

缺点
技术非常复杂
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简单序列重复(SSR)
简单序列重复(SSR)即微卫星DNA
微卫星是指以少数几个核苷酸( 1~ 6 个) 为单位 多次串联重复的DNA序列。 微卫星由核心序列和两侧的保守侧翼序列构成 。保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某 一区域，核心序列重复数的差异则形成微卫星的高 度多态性。
小卫星DNA ( Minisatellite DNA ) ；
简单序列重复SSR( Simple Sequence Repeat )，即
微卫星DNA。
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以PCR为基础的分子标记技术
随机扩增多态性DNA( RAPD )；
扩增片段长度多态性 (AFLP) ；
单链构象多态性(SSCP)；
限制性片段长度多态性(RFLP) 由Grozdicker创立，并于1980 年由Bostein 再次 提出。 原理：限制性内切酶能识别并切割基因组DNA分
子中特定的位点，如果因碱基的突变、插入或缺失
，或者染色体结构的变化而导致生物个体或种群间
该酶切位点的消失或新的酶切位点的产生。
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那么利用特定的限制性内切酶切割不同个体的 基因组DNA， 就可以得到长短、数量、种类不同的
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类型及原理
现已出现的分子标记技术有几十种，部 分分子标记技术所属类型如下： 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术
限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP )； 染色体原位杂交(CISH)。
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以重复序列为基础的分子标记技术
卫星DNA (Satellite DNA ) ；
cDNA-扩增片段长度多态性(cDNA-AFLP )；
靶位区域扩增多态性(TRAP)；
序列特征化扩增区域(SCAR)； 相关序列扩增多态性(SRAP )。
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以mRNA为基础的分子标记技术
表达序列标签(ESTs) ；
差异显示(DD) ；
逆转录PCR (RT-PCR) ；
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所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰
富的多态性而发展起来的可直接反映生物个 体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标 记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标 记之后最为可靠的遗传标记技术。
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广义的分子标记是指可遗传的并可检测
的DNA序列或蛋白质分子。
通常所说的分子标记是指以DNA多态性 为基础的遗传标记。 分子标记技术本质上都是以检测生物个 体在基因或基因型上所产生的变异来反映基 因组之间差异。
建立在PCR基础上的一种可对整个未知序
列的基因组进行多态性分析的DNA分子标记技
术。
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随机扩增多态性DNA(RAPD)
原理：
1.利用一个随机引物( 一般为10个碱基) 通过PCR反
应非定点地扩增DNA片段；
2.扩增片段经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分
离；
3.溴化乙锭染色或银染等专一性染色技术即可记录
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扩增片段长度多态性(AFLP)
AFLP 是1992年由荷兰Key gene公司的科学家
Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的分子
标记方法。
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扩增片段长度多态性(AFLP)
原理
1.基因组DNA经限制性内切酶双酶切后， 形成分子 量大小不等的随机限制性片段； 2.将特定的双链接头连接在这些DNA片段的两端, 形成一个带接头的特异片段；
可以作为通用探针。
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限制性片段长度多态性(RFLP)
应用
在基因突变分析、基因定位、基因诊断、个体
识别、亲缘鉴定、物种分类和进化关系研究，以及
组建高密度的遗传图谱和育种操作等方面都有一定
的应用和重要的实用价值。
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限制性片段长度多态性(RFLP)
优点
标记广泛存在于生物体内，不受组织、环境和发 育阶段的影响。 RFLP 标记的等位基因是共显性的，不受杂交的 影响，可区分纯合基因与杂合基因。 可产生的标记数目很多，可覆盖整个基因组。
染色体原位杂交在原位杂交技术中应用最广泛 ，它是一种基于Southern 杂交的分子标记技术。
原理：
该技术利用特异性核酸片段作探针, 直接同染色体
DNA 片段杂交, 在染色体上显示特异DNA 。
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染色体原位杂交(CISH)
探针
可采用同位素标记探针, 杂交后通过放射
自显影显示杂交信号, 也可以采用非放射性大 分子如生物素、地高辛等标记特异核酸片段, 杂交信号经酶联显色或荧光显色得以显示。 优点 准确、直观
ESTs( Expressed Sequence Tags)是在人类基 因组计划实施过程中，由美国国立卫生研究院
生物学家Venter J提出的发现基因的新战略。
ESTs是指从cDNA文库中随机挑取克隆并对
其3’或5’端进行单轮测序所获得的短cDNA序列，
一般长度为300~500bp。
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表达序列标签标记技术(EST)
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单核苷酸多态性标记(SNP)
应用
种群生物学特征、遗传性疾病检测、疾病关联
分析及特定功能基因或片段的分型等研究，在基因
组作图和数量性状定位等方面也有越来越多的应用。 优点 数量多，分布广泛，检测快速、
易于实现自动化，遗传稳定性高。
缺点
成本高，错误信号多。
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表达序列标签标记技术(EST)
在医学、农业、林业、畜牧业、渔业等领域中
得到了广泛的应用。
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扩增片段长度多态性(AFLP)
优点 高度特异性，实验周期短， 可信度高，检测速度快。 缺点 技术过程复杂，实验成本较高，
且受专利保护。
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单核苷酸多态性标记(SNP)
SNP主要是指在基因组水平上由于单个核苷
酸的变异所引起的DNA 序列多态性。也即SNP
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姓 学 名：赵 淑 莉 校：吉林大学
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主要内容
1 2 3
概 类
述 型
原理及应用
4
致
谢
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概 述
分子标记技术(Molecular Markers)
1974年,Grozdicker 等人在鉴定温度敏感表型的腺
病毒DNA突变体时， 利用限制性内切酶酶解后得到 的DNA片段的差异，首创了DNA分子标记。
物在电泳图谱中DNA带数增加、减少或片断长度
发生相应变化。从而可以检测出基因组DNA在这
些区域的多态性。
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随机扩增多态性DNA(RAPD)
应用
RAPD技术广泛应用于天然居群内及居群间 的遗传变异、种质资源搜集、品种鉴定、种间 或属间遗传关系、遗传图谱构建、基因定位与 分离等方面的研究。
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单核苷酸多态性标记(SNP)
检测
DNA芯片技术，最新报道的微芯片电泳
(Microchip electrophoresis) ，可以高速度地检测
临床样品的SNP。 杂交型芯片将等位基因特异寡核苷酸共价固 定在载体表面，用荧光标记引物扩增基因组DNA， 再与芯片上的寡核苷酸杂交形成信号，并行读取 芯片上不同SNP 荧光信号，获得SNP 信息。
差异显示逆转录PCR (DDRT-PCR) ； 特征性差异分析(RAD) ； 基因表达系列分析(SAGE) 。
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以单个核甘酸的变异为核心的分子标记技术
单核苷酸多态性标记(SNP)
以特定序列为核心的分子标记技术
线粒体DNA分子标记(mtDNA)
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代表性分子标记技术的原理
限制性DNA片段，通过电泳和Southern杂交转移到
硝酸纤维素膜或尼龙膜上, 选用一定的DNA标记探
针与之杂交，放射自显影后就可得到反映个体特异
性的DNA限制性片段多态性图谱。
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限制性片段长度多态性(RFLP)
探针： 通常是随机克隆的与被检测物具有一定同源性 的单拷贝或低拷贝基因组片段或cDNA片段。其中 cDNA 探针保守性较强，许多同科物种cDNA 探针都
优点
数量多，分布广泛，检测快速、 易于实现自动化，遗传稳定性高。
缺点
获得的基因组信息不全，费用高， 对DNA质量和cDNA文库要求高。
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相关序列扩增多态性(SRAP)
是基于PCR 技术的新型分子标记技术
原理
利用基因外显子里G、C含量丰富， 而启动子和内 含子里A、T含量丰富的特点设计两套引物，对开放 读码框架进行扩增。
应用
适合于不同作物的基因定位、基因克隆和遗传图谱 构建等
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相关序列扩增多态性(SRAP)
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简单序列重复(SSR)
原理：
由于重复次数的不同及重复程度的不完全造成
了每个位点的多态性。
根据其两端的保守序列设计一对特异性引物，
PCR 扩增，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可显示不同
基因型个体在这个SSR位点的多态性。
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简单序列重复(SSR)
应用
是种群研究和进化生物学最常用的分子标记之
RAPD 指纹；
4.进行DNA 多态性分析。
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随机扩增多态性DNA(RAPD)
RAPD所用的一系列随机引物其序列各不相同，
结合位点不同，扩增得到的DNA片段的区域不同。 如果基因组的这些区域发生DNA片断或碱基的 插入、缺失等突变， 就可能导致这些特定结合位 点、扩增片断发生相应的变化。而使RAPD扩增产
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3.通过接头序列和PCR引物3’末端的选择性碱基的 识别，扩增那些两端序列能与选择性碱基配对的 限制性酶切片段； 4.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将特异的限制性片段 分离开来；
5.然后利用成像系统和分析软件检测凝胶上DNA
指纹的多态性。
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扩增片段长度多态性(AFLP)
应用
AFLP作为一种高效的指纹技术，已在遗传育种 研究中发挥它的优势。
个基因组，而且不需要同位素，安全性好。 复旦大学
随机扩增多态性DNA(RAPD)
缺点：实验的稳定性和重复性差
显性遗传，不能识别杂合子位点，这使得遗
传分析相对复杂，在基因定位、作连锁遗传
图时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗
传距离的准确性下降；
RAPD对反应条件相当敏感，包括模板浓度、
Mg2+浓度，所以实验的重复性差。
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限制性片段长度多态性(RFLP)
缺点
标记技术需要酶切, 对DNA 质量要求高；
RFLP 的多态性程度偏低；
分子杂交时会用到放射性同位素，对人体和环境
都有害；
探针的制备、保存和发放也很不方便； 分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。
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染色体原位杂交(CISH)
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表达序列标签标记技术(EST)
数据库
目前常用的含有ESTs子数据库的有：
NCBI的GenBank；
欧洲分子生物实验室的EMBL；
日本国家数据库DDBJ。
应用
构建遗传学图谱、分 离与鉴定新基因、
基因差异表达的研究、基因的定位克隆
用于制备cDNA芯片等。
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wk.baidu.com
表达序列标签标记技术(EST)
一，广泛地应用于生物杂交育种、遗传连锁图谱、
种群遗传多样性、系统发生等研究领域。
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简单序列重复(SSR)
优点
分布广泛、多态性丰富、杂合度高、通用性好 以及扩增反应所需模板量少、重复性好，共显性遗 传、检测方便、结果稳定。
缺点
增大了基因型错误判别的可能性。
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随机扩增多态性DNA(RAPD)
原理
由于ESTs是短的核苷酸序列，而且根据构建
文库时所采用引物的差异，所测定的序列可以是
cDNA的各个区段，包括5’末端和3’末端，以及5’
上游非翻译区( UTR)和3’UTR，也可以是cDNA
的任何内部序列。因为cDNA来源于mRNA, 所
以每一个EST’均代表了文库构建原组织的基因组
DNA中一个表达基因的部分转录片段。
随机扩增多态性DNA(RAPD)
优点：
技术简单，实验周期短，信息量大，检测速度
快；DNA用量少；
实验设备简单，不需DNA探针， 设计引物也
不需要预先克隆标记或进行序列分析；
不依赖于种属特异性和基因组的结构，合成一
套引物可以用于不同生物基因组分析；
用一个引物就可扩增出许多片段，几乎覆盖整
是同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个
碱基的变化。
主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起
的DNA序列多态性，包括单碱基的转换或颠换、
以及单碱基的插入或缺失等。
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单核苷酸多态性标记(SNP)
原理：
SNP 与RFLP及SSR 标记的不同有2 个方面： 其一，SNP 不再以DNA 片段的长度变化作 为检测手段，而直接以序列变异作为标记； 其二，SNP 标记分析完全摒弃了经典的凝胶 电泳，代之以最新的DNA 芯片技术。 对成千上万个克隆测序，用计算机分析数据 和显示最终结果。