细胞电穿孔技术的研究

中国民航大学
硕士学位论文
细胞电穿孔技术的研究
姓名：孙云
申请学位级别：硕士专业：通信与信息系统指导教师：徐宝强
20070220
中Ｎ民航人学硕卜学位论叟：
物增敏、临床医学等诸多方面，给医疗技术带来了一场革命。

２１世纪是生物工程的时代，电穿孔技术也在不断发展完善，在应用领域出现了方兴未艾的局面，有着巨大的应用潜力。

因此分析研究细胞电穿孔的机理，研制我国具有自主知识产权的电转基因仪器和与之配套的多种电极，将具有重大意义，不仅会推动我国的生物工程的发展，而且必将产生良好的经济和社会效益。

１．２国内外研究现状
１．２．１细胞膜结构
细胞膜的结构非常复杂，主要是由脂质和蛋白质两类物质组成的复杂的超分子动态系统。

１９７２年Ｓｉｎｇｅｒ和Ｎｉｃｏｌｓｏｎ提出的液态镶嵌模型１２４｜，目前已得到人们的承认。

液态镶嵌模型认为细胞膜是一种可流动的、嵌有蛋白质的脂类双分子层结构。

嵌入其中的蛋白质具有多种功能，如离子通道、受体及各种酶等。

构成细胞膜的脂类主要有甘油磷脂、鞘磷脂、类固醇和糖脂，如图１－１所示。

这些脂类除了类固醇外，都有亲水的极性的头部和疏水的非极性的尾部。

脂类分子极性头部向外，疏水的尾部在内，构成细胞膜的基质——脂双分子层。

图１－１细胞膜的生物结构
１．２．２细胞膜电穿孔模型
对于细胞膜的可逆电穿孔，众多的理论模型都没有对电穿孔过程进行系统的描述，只有ＪａｍｅｓＷｅａｖｅｒ建立的瞬叁亲水孔模型１２５１，对电穿孔进行了宏观描述。

定性地说，电穿孔现象是由电能（因跨膜电位提高而产生的决定性能量）和“ＫＴ能量”（因热波动而产生的随机性能量）共同作用而引起的。

大量的观察发现，电穿孔
图３－５组合电容
３．１．５其他方面
为了实现产业化，对原有的放电小池进行彻底改造，先后设计研制出几套模具，实现了ｌｍｍ、２ｒａｍ、４ｍｍ三种不同规格的放电小池。

其中２ｒａｍ、４ｍｍ小池的电极有粘贴型的，１ｌｎＩｎ、２ｒａｍ小池电极有采用工字铝注塑型的，如图３－６所示。

图３－６电击小池
同时研制出各种放电电极，如用于动物原地药物注入（药物增敏）和转基因的针电极（平行和梅花形），从而达到药物增敏的效果和基因治疗的目的。

ＩＮ．３０１基因脉冲导入仪采用点阵式Ｕ＝Ｄ显示，能够同时显示多个信息，可做到汉字、字符同屏，便于用户的操作和使用。

ＬＮ．３０１基因脉冲导入仪的特点为：在设计上，由于采用了汉字显示方式，易于操作，简单明了，使用非常方便；在技术上，为了避免高压放电对单片机的干扰，采用了数字地和模拟地各自独立的方式，使该仪器的稳定性、可靠性得到较大的提高。

单片机的工作流程图如图３．７所示。

单片机的功能主要完成对记录键盘输入数据，完成输出规定脉冲的控制以及控制液晶屏显示等功能。

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图４－１ＬＮ·１０１基因脉冲导入仪
电脉冲产生器产生按指数规律衰减的电脉冲，由导线引至针阵列电极。

我们在设计中，经过多次讨论，成功设计出经济实用的针阵列电极，并且针对小鼠肿瘤组织的大小和特点，设计了多套不同尺寸的针阵列电极。

我们选用银针作为电极，将银针固定在聚四氟乙烯的材料上。

针阵列电极一共有七根针组成，圆心处设置一根，其余六根针均匀地分布在半径为Ｒ的圆周上，电极示意图如图４．２所示。

圆的半径Ｒ约为ｌｃｍ，Ｒ的大小可视肿瘤体积而定，Ｒ直接影响阵列间的场强大小，这对于提高细胞膜电穿孔的效率是很重要的．
图４．２插入肿瘤的针阵列电极的三维图
４．３电化学疗法的治疗过程
电化学疗法的治疗过程ｆ６２ｌ是首先将药物注射到肿瘤组织里，如图舢３所示；几分钟后，将针阵列电极插入肿瘤组织，选取的针阵列电极的直径应大小合适，使肿瘤组织尽
可能被包括在针电极的电场内，然后将电穿孔仪产生的脉冲电场通过针电极作用于肿瘤组织，如图¨所示。

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圈４．３药物注射入肿瘤组织
图４．４针电极插入肿瘤并加脉冲电场
图４－５展示的是将电脉冲作用于细胞后促进药物吸收的过程。

未进行电穿孔时，细胞膜对于ＢＬＭ等大分子药物而言较难渗透；加电脉冲后细胞膜上产生微孔，药物可进入细胞；电穿孔结束后，细胞膜又再次封闭，进入细胞内的药物开始起作用。

图＂细胞电穿孔后吸收药物的过程
中【日Ｋ航人半坝卜擘ｎ沦立：
官时，平行板电极局限性更是显而笏地，因此人ｆｆ．』又开始设计新的ｆ乜极。

新型的电极有同轴电极，针阵列电极，最近义提出了微针阵列电极等。

同轴电极包括单同轴电极和多尉轴电极，可产生发散的电场，它的优点是可直接对贴壁生长的细咆进行电穿孔，多同轴电极还可以同时对多个样本细胞进行电穿孔处理。

已研制出的同轴电极有美国ＢＴＸ公司的４９１．１，７４７，８４０等型号…。

针阵列电极的类型就更加丰富，有两针电极、四针电极、六针电极、八针电极等，针的排列有两行平行排列，也有在圆周上均匀分布的１７”。

针电极的材质有不锈钢的，也有针灸用的银针。

相对于平行板电极而占，针电极可直接插入肿瘤组织内部，治疗的范围不在局限于皮肤表层，应用更加广泛。

但是针电极也有不足之处，电极插入肿瘤组织时会有一定的疼痛感，在治疗较大的肿瘤或肿瘤数较多时需要局部麻醉或全身麻醉。

近几年又出现了微针阵列电极１７６ｊ。

Ｉ鲫ｌ，主要用于经皮给药，将ＤＮＡ导入进行基因治疗等。

在进行皮肤的基因治疗时，微针电极有两个作用，一是运输作用，由于使用前已在针电极表面涂有ＤＮＡ，在插入的过程中可将ＤＮＡ导入上皮；二是当微针插入皮肤后，可作电极使用。

微针电极间的距离非常近，在微米级，所以相对较低的电压就可以产生较大的场强。

目前微针电极还处在初步研究阶段，一是电极形状还在优化过程中，现在出现的有近似圆锥体的电极，多棱锥体电极等。

由于外形设计直接影响微针穿透皮肤的能力和电极的机械性能，如强度、抗剪切的能力等，因此需要进一步改进；二是铸造工艺有湿性刻蚀、干性刻蚀等，但仍需要改进；三是选用材料一般为硅，但加工过程的处理费用很高，正在尝试用导电聚合体来代替。

图５．１为两种不同外形的微针阵列电极，左图采用湿性刻蚀技术加工，电极高２３０＃ｍ，底部直径为１８０／．ｔｍｒ右图采用于性刻蚀技术加工，电极高为２５０，ｕｍ，底部直径为２００
微针阵列电极中针的高度为微米级，一般在２５０～３００＃ｍ比较理想。

２００５年在欧洲召开的第三届医疗生物工程会议上有多篇介绍微针阵列电极的文章，这也从一个侧面表明微针阵列电极越来越受到入们的关注，已经成为电极发展的一个新方向。

图５－１微针阵列电极
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５．３小鼠实验用针电极的改进
在第四章的实验中已经介绍了七针电极，七根针均为实心针炙用针。

它的结构是一根针位于圆心处，其余六根针均匀分布在半径为Ｒ的圆周一Ｉ－。

我们对电极进行了两点改进，一是将针电极与注射器巧妙的结合，使注射器的针头巧妙替代了原针电极中位于圆心处的实心针，这样药物可以直接通过针电极注射到肿瘤组织中：二是位于圆周上的六根针可灵活伸缩，且充分利用注射器本身的刻度准确控制针电极插入肿瘤组织的深度，这样就可以限据肿瘤的大小对插入深度做相应调整。

改进后的七针阵列电极如图５．２所示。

该电极的最大特点是一针两用，在加电脉冲之前周围六针收缩到针腔内，仅有圆心处一根针电极可见，此时电极可当注射器使用，将抗癌药物通过中阃的有孔的针注射到肿瘤组织里；注射完后，圆周上的六针电极从针腔内伸出，作为电极的负极，中问的针又作为针电极的正极使用，然后一同插入要治疗的肿瘤组织里，此时发挥电极的作用。

图５－２七针电极
５．４新设计的六针阵列电极
５．４．１电极的设计思路及预期效果
在设计新的针电极时，从以下三点进行考虑：
１、由第二章的分析可知，增加脉冲个数能增大细胞电穿孔的效率，但达到一定的脉冲个数，穿孔几率将不再增加，脉冲个数一般为３～１１个。

在查阅了大量资料后，参考多组实验数据和实验效果，并结合电极结构最终确定每组脉冲为６个。

２、将上一小节中对针电极的改进思路即针电极与注射器二合一的思想应用到新电极的设计中，使新电极也具备了改进后七针电极的优点，但此时位于圆心处的针作用只有一个，即只用于注射药物，没有电连接。

３、均匀分布在半径为Ｒ的圆周上的六根针不是同时工作，六针中每次只有相邻两
中旧民航人学坝ｌ。

｝扣论支
针和与之相对的两针工作，加一次脉冲变换一次丁作电极，～组有六个脉冲，变换六次工作电极。

预期效果：通过施加一组六个脉冲且每个脉冲作用Ｆ不同的电极，使针电极处的肿瘤能充分接受电脉冲的作用，提高肿瘤细胞的穿孔效率，进而提高药物吸收率。

但是电场对于肿瘤组织以外的正常细胞的影响要尽可能小，即针电极电场在以注射点为圆心以２ｂ为半径的圆内场强较强，而圆外场强减小，不致损伤机体的正常细胞。

５．４．２针阵列电极及配套的循环放电控制器
根据上一节的设计思路设计出如图５．３所示的六针阵列电极，电极的六根针分别用六根导线引出，通过配套的插头与图５－４所示的循环放电控制器相连。

图５－３六针电极
循环放电控制器的作用是控制脉冲的加载方式、顺序和针电极的极性变换。

它的控制面板由四部分组成，包括测试／操作开关，六波段选择开关，顺时，逆时开关，六个指示灯。

左侧为测试／操作开关，开关打向“测试”位，此时针电极不加电，控制器进行内部电连接自检，并与六指示灯和波段选择开关配合使用。

波段选择开关打在“１”位，指示灯１、２和４、５亮，图５．４正为此检测状态；打在“２”位，指示灯２、３和５、６亮，依次类推，检测与针电极相连的内部转换控制部分工作是否正常。

图５－４检测状态的循环放电控制器
中国民航丈学硕士学位论文
（Ｏ．Ｏｌ、ｒｌｍｍ，０．０３Ｖ／ｍｍ，０．０５Ｖ／ｍｍ，０．０７Ｖ／ｒａｍ，０．ＯｇＶ／ｍｍ，０．１、／Ｉｍｍ，０．１５Ｖ／ｍｍ，Ｏ．３Ｖ／ｍｒｎ）的等场强线，其中黑色对应无修正项的等场强线，彩色对应有修正项的等场
图５．１０等场强线分布图图５－８等电位线分布图图５－９等电位线比较图
图５．“等场强线比较图。