探讨大鼠肝硬化动物模型的建立方法_郑敏

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(本文编辑　朱化刚)
【作者单位】1.温州医学院附属二院,温州　325027
2.温州医学院实验动物中心
【作者简介】郑敏,女,博士,副教授,副主任医师。

研究方向:乳腺外
科、肝脏外科。

【收稿日期】2005-12-09
探讨大鼠肝硬化动物模型的建立方法
郑　敏1
,陈　聪1
,赵雅萍1
,吴娟丽
2
【摘要】　目的　探讨根据体重监测建立一种理想的大鼠肝硬化模型的方法。

方法　90只大鼠随机分成3组,1组为对照组,2组按传统的方法诱导肝硬化的模型,3组按逐步增高四氯化碳和乙醇浓度的方法诱导肝硬化的模型。

观察3组大鼠的体重变化,门静脉压力的变化,死亡率和肝假小叶形成率。

结果　1组大鼠体重明显增加,门静脉压力无变化,无死亡,无肝硬化形成。

2组大鼠体重早期明显下降,后期缓慢增加,门静脉压力明显升高,死亡8只,死亡率26.7%,假小叶形成率66.7%。

3组大鼠早期体重缓慢下降,后期缓慢增加,门静脉压力明显升高,死亡3只,死亡率10%,假小叶形成率86.6%。

结论　逐步增加四氯化碳及乙醇的浓度,并食用白酒代替乙醇可以缩短肝硬化形成的时间,提高形成率,降低死亡率。

【关键词】　大鼠;肝硬化;动物模型;四氯化碳
【中图分类号】　R657.3+1 【文献标识码】　A 【文章编号】　1006-4761(2006)02-0136-02
STUDY ON THE METHOD OF INDUCING C IRR OHSIS MOD EL IN RATS (Z heng Min ,Cheng Cong ,Z hao Y a -ping ,et al .Department of general Surgery ,The Second Af f liated Hospital of WenZhou Medical College ,Wen zhou 325027,China )
【Abstract 】　Objective T o probe an reliable technique to induce cir rhotic model in ra ts by mo nito ring weight chan -ge s .Methods 90male SD ra ts w ere ra ndomly divided into three g ro ups .G roup I w as co ntr ol gr oup ,and w ere treated w ith no CCl4and eatable alcohol .　G roup Ⅱwer e tr eated with tr aditional means .G r oup Ⅲw ere treated w ith CCl4a nd eatable alcoho l .T he co ncentra tion of CCl4and eatable alcoho l were increased stage by stage in a certain range during the ex pe riment .The chan -g es o f w eight and PV P ,the fo rma tion rate o f live r cirrho sis false lobe and mo rtality in three g ro ups w ere obse rved .Results A f -te r being indused w ith abo ve means of 8w eeks ,the r at mo r ta lity in g r oup I w as 0,g roup Ⅱw as 26.7%,g roup Ⅲw as 10%.T he fo rmatio n rate of live r cir rhosis false lo be in g roup I w as 0,g ro up Ⅱwa s 66.7%,g ro up Ⅲwas 86.6%.Conclusion T he cirr ho tic model in ra ts w ere induced by moderately increasing the concentr ation of CCl4and adopting eatable alco ho l in stead of e thanol sho wed a lo w mo rtality and hig h success ra te .
【Keywords 】　Rats ;Cirr ho sis ;A nimal mo del ;Carbontetr achloride 乙型肝炎后肝硬化是威胁我国人民的一种严重的疾病,在我国发病率比较高,也是一种常见及重要的死亡原因。

建立一个类似于人类肝硬化的动物模型是深入研究肝硬化不可缺少的环节。

以往的肝硬化动物模型的制作周期较长,死亡率较高,为此我们改良的动物模型的制作方法,应用逐步提高四氯化碳浓度,饲料中混合猪油,并将食用白酒掺入大鼠食用水中,并监测大鼠体重和门静脉压力的变化,探讨一种理想的肝硬化动物模型的建立方法。

1　材料与方法1.1　实验动物
纯系SD 雄性大鼠90只,体重180～210g ,购自上海西普-毕凯实验动物有限公司,按清洁级标准饲养于温州医学院实验动物中心,普通颗粒饲料及葵花籽喂养。

将实验动物分成3组,每组30只。

1组大鼠为对照组:按0.3ml /100g 体重给予橄榄油溶液皮下注射,每周2次,普通饲料及葵花籽加清水喂养;2组大鼠按传统方法诱导肝硬化模型[1];3组大鼠按实验的方法诱导肝硬化动物模型。

1.2　试剂
四氯化碳购广东汕头西陇化工厂,批号20020406,1%硫贲妥钠为上海新亚制药厂产品,批号,20030101,市售品牌白酒,市售橄榄油。

1.3　肝硬化动物模型的制作
2组大鼠按0.3ml /100g 体重给予40%四氯化碳橄榄油
136
肝胆外科杂志2006年4月第12卷第2期　Journal of Hepatobiliary Surgery ,Vol .14,No .2,Apr .2006
溶液,双下肢轮流皮下注射,每周2次,连续12周,给予普通颗粒饲料及葵花籽和清水喂养。

3组大鼠按0.3ml/100g体重给予40%四氯化碳橄榄油溶液2周,2周后改为50%四氯化碳橄榄油溶液,应用2周,从第5周改为60%四氯化碳橄榄油溶液,应用4周,双下肢轮流皮下注射,每周2次。

第1、2周给予5%乙醇溶液作为饮用水,第3、4周给予10%乙醇溶液作为饮用水,第5～8周给予20%乙醇溶液作为饮用水(乙醇溶液由上述白酒加蒸馏水配制)。

共诱导8周,给予普通颗粒饲料混合猪油及葵花籽喂养,同时每周监测大鼠体重变化。

1.4　门静脉压力的测定及病理组织学检查
3组大鼠8周后、1组大鼠和3组大鼠12周后,用1%硫贲妥钠50mg/kg腹腔内注射麻醉,开腹经胃网膜右静脉用4号穿刺针穿刺测量门静脉压力,切取部分肝右叶做病理组织学检查。

1.5　统计学处理
采用t检验。

2　结果
2.1　大体观察
1组大鼠毛发有光泽,活动多,精神状态好,食欲佳,而2组和3组大鼠毛发凌乱无光泽,食欲差,精神萎靡活动少,对外界刺激反应慢。

2.2　体重的变化
1组大鼠体重逐渐增加,实验组大鼠体重前期下降,后期增加缓慢,第8周时,2组大鼠体重与1组大鼠体重相差约28%,(260±10g)v s(388±12g),P<0.01。

3组大鼠体重与1组大鼠体重相差约30%,(255±18g)v s(388±12g),P <0.01。

2组大鼠体重与3组大鼠体重无明显差异,(260±10g)vs(255±18g),P>0.05。

2.3　病死率和肝硬化形成率
1组大鼠无死亡,也无肝硬化结节形成。

2组大鼠死亡8只,死亡率26.7%。

3组大鼠死亡3只,死亡率10%,P< 0.05。

2组20只大鼠观察到肝硬化结节及假小叶形成,假小叶形成率66.7%,3组观察到26只大鼠肝硬化结节及假小叶形成,假小叶形成率86.6%,P<0.05。

2.4　门静脉压力的改变
1组大鼠门静脉压力为10.8±0.5cmH2O,2组大鼠门静脉的压力为19.5±0.4cmH2O,3组门静脉压力为19.6±0.3cmH2O,2组和3组与1组相比差异显著P<0.01,2、3组之间差异不明显P>0.05。

2.5　肝脏组织学改变
1组肝脏红润,表面光滑无结节,2组和3组肝脏表面可见小结节形成,部分腹腔内可见腹水,镜下可见纤维组织增生,肝细胞结节状再生和假小叶形成。

3　讨论
四氯化碳是使用最早、应用最广泛的肝纤维化诱导剂[1、2],经过多年的应用,其结果已经被证实。

其诱导肝脏损害的机理主要是共价结合脂质过氧化和细胞内钙稳态失调。

四氯化碳经肝脏代谢产生氧自由基,启动二次反应,直接破坏肝细胞,导致肝细胞的脂肪变性和坏死。

乙醇是酶的诱导剂,可以加强四氯化碳的毒性,当乙醇进入肝细胞后,在乙醇脱氢酶及微粒体氧化系统共同作用下,氧化为乙醛,再进一步氧化为乙酸,在此过程中,辅酶I转变为还原型辅酶I,使辅酶I减少,还原型辅酶I相对增加,两者比例下降,抑制了线粒体内正常的三羧酸循环过程,且乙醇可以直接损伤线粒体,增加细胞的氧耗量,上述改变使脂肪酸氧化减少,合成增加超过了肝脏的处理能力,甘油三酯在肝内堆积导致肝细胞脂肪变[3]。

四氯化碳与乙醇联合应用可以促进肝硬化的形成[4]。

以四氯化碳和乙醇为主诱导肝硬化已经成为诱导肝硬化的方法[1、2、4]。

但是此种方法需要时间较长,约12周,而且高浓度的四氯化碳直接注射可以导致部分大鼠出现急性肝功能衰竭而死亡,且部分大鼠拒绝饮用乙醇亦导致死亡[5]。

3组大鼠采用逐渐增加乙醇及四氯化碳浓度的方法,使大鼠有一个逐渐适应的过程,同时在饲料中混合猪油,通过监测体重,发现大鼠早期体重下降并不十分剧烈,肝功能衰竭导致的死亡与2组大鼠相比较明显减少,后期两组大鼠体重无明显差异。

虽然2组大鼠应用的四氯化碳浓度低于3组大鼠,且未应用乙醇,但是2组大鼠应用四氯化碳的时间长达12周,明显长于3组大鼠,所以其死亡率高于3组大鼠。

3组大鼠肝硬化的形成率较高,随着鼠龄的增加,肝细胞对毒性物质的敏感性逐渐降低,且随着肝功能逐步下降,肝细胞内P450含量逐渐下降,逐步增加的四氯化碳和乙醇可以维持对肝细胞的损害强度,因脂肪氧化减少,肝细胞内脂肪堆积,肝细胞破坏,假小叶形成,造成肝硬化的形成,门静脉压力明显升高,部分大鼠出现了腹水。

采用食用白酒代替医用乙醇,口感好,虽然浓度逐渐增加,可能大鼠已经适应,也未出现大鼠拒绝饮用情况。

采用逐渐增加四氯化碳及乙醇浓度的方法,可以缩短成模时间,肝硬化形成率高,死亡率低,通过监测体重初步估计肝功能有无衰竭的可能。

参考文献
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Taehan K an H akhoe Chi,2002,8(2):173-178.
(本文编辑　朱立新)
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肝胆外科杂志2006年4月第12卷第2期　Journal of Hepatobiliary Surgery,Vol.14,No.2,Apr.2006。