一种构建全长cDNA文库的方法
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Ｆ１： ５’ !ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＡＣ ＧＧＣＣＧＧＧ!３’
Ｒ２： ５’!ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ !ｄ（ Ｔ）
基金项目 作者简介 收稿日期
河北省秦皇岛科技局转基因动物生产基因工程药物研究项
目（ Ｄ０８） 。 刘 红军（ １９７４－ ） ， 男， 河南 汝州 人， 硕 士研 究生， 研 究方 向： 动 物生殖生理与调控技术。＊ 通讯作者， 教授， 博士生导师。 ２００６! ０９! １４
ＰＣＲ 程序设置： ９５ ℃预变性 １ ｍｉｎ； ９５ ℃变性 １５ ｓ， ６８ ℃ 复性 １ ｍｉｎ， ６８ ℃延伸 ６ ｍｉｎ， 进行 ２０ 个循环； ４ ℃保温 ３０ ｍｉｎ。 扩增产物用浓度为 １．０ ％的琼脂糖凝胶电泳鉴定合成的 ｄｓ! ｃＤＮＡ 的大小。 １．２．４ ＰＣＲ 产物的纯化。取 ５０ μｌ ＬＤ!ＰＣＲ 产物， 加入 ２ μｌ 蛋白酶 Ｋ （ 浓度为 ２０ μｇ／μｌ） ， 瞬时离心混匀， ４５ ℃孵育 ２０
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒ ａｒ ｙ Ｃｏｎｓｔｒ ｕｃｔｉｏｎ ＬＩＵ Ｈｏｎｇ!ｊｕｎ ｅｔ ａｌ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆．Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙａｎｇｌｉｎｇ， Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００） Ａｂｓｔｒ ａｃｔ Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｌｏｎｇ!ｄｉｓｔａｎｃｅ ＰＣＲ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｌａｃｅｎｔａ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｃＤＮＡ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＲＴ!ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｅｌｐ ｏｆ Ｍ!ＭＬＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｅｎｚｙｍｅ． Ｔｈｅｎ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ （ｄｓ!ｃＤＮＡ） ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ＳｆｉⅠ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＬＤ!ＰＣＲ （Ｌｏｎｇ!ｄｉｓｔａｎｃｅ!ＰＣＲ） ａｎｄ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ＪＧ４５ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｓｆｉ Ｉ． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ａｎｄ ｔｈｅｎ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ． Ｔｈｅｎ ｑｕａｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ７．０１×１０５ ｃｌｏｎｅｓ ｐｅｒ μｇ ｄｓ!ｃＤＮＡ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒａｔｅ ｏｆ ９６％． Ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ８０ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｓ， ｎｏ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ． ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ Ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ； Ｌｏｎｇｄｉｓｔａｎｃｅ!ＰＣＲ； Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
自 ２０ 世 纪 ７０ 年 代 中 期 首 例 ｃＤＮＡ 克 隆 问 世 以 来 ， 已 经 发 展 了 许多 旨 在 提 高 ｃＤＮＡ 合 成 效 率 和 长 度 的 方 法 ， 并 对载体系统进行了大量改进。大多数 ｃＤＮＡ 文库的构建利 用的是 λ噬菌体载体系统， 尽管该系统在载体的设计方面 非常成熟， 然而， 该系统构建过程中同位素对研究人员造成 的危害以及构建文库的周期长、成本高等， 限制了其实际应 用 价 值 。 传 统 ｃＤＮＡ 文 库 构 建 方 法 由 于 反 转 录 能 力 差 ， ｃＤＮＡ 内切酶位点保护不彻底和非 ｃＤＮＡ 片断的插入， 导致 了文库中克隆片断短、全长率低和无效克隆多， 已经不能适 应 目 前 大 规 模 、高 通 量 、高 效 的 功 能 基 因 组 研 究 需 要 。因 此 ， 寻找一种新的、快速、高效的构建全长 ｃＤＮＡ 的文库方法具 有重要的现实和经济意义［１］。为此， 笔者以人胎盘组织为材 料， 研究了一种以 ＬＤ!ＰＣＲ 为基础的简单快速且相对高效 的构建全长 ｃＤＮＡ 文库的方法。 １ 材料与方法 １．１ 材料 人胎盘组织， ＪＧ４５ 质粒和 Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ 菌株， 由 西北农林科技大学动物科技学院实验室保存； Ｍ!ＭＬＶ 反转 录酶， ＳｆｉⅠ限制性内切酶， Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ 聚合酶， Ｔ４ ｌｉｇａｓｅ 及 ＤＥＰＣ， 购自大连宝生物公司； 质粒小量快速提取试剂盒， ＰＣＲ 产 物 纯 化 试 剂 盒 ， 购 自 Ｂｉｏ!Ｄｅｖ 公 司 ； Ｔｒｉｚｏｌ， 购 自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公 司 ； 引物 合 成 和 测 序 ， 由 上 海 ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 生 物 公 司公司完成； 其余试剂均为国产分析纯。引物序列为：
１３０６
安徽农业科学
２０源自文库７ 年
ｍｉｎ， 用 ｄｄＨ２Ｏ 补至 １００ μｌ， 等体积酚／氯仿抽提， 无水乙醇沉 淀 ， 沉 淀 溶 解 于 适 量 的 ｄｄＨ２Ｏ 中 ， 并 用 Ａ２６０／ Ａ２８０ 计 算 ｄｓ" ｃＤＮＡ 的浓度， 调整其终浓度为 ０．１ μｇ／μｌ。 １．２．５ ｃＤＮＡ 文库的构建及鉴定。取 ２ μｌ ｄｓ"ｃＤＮＡ， 按 ｃＤＮＡ 与载 体 摩 尔 比 为 ３∶１ 加 入 经 同样 酶 切 的 质 粒 载 体 ＪＧ４５， 在 ２０ μｌ 连接 体 系 中 加 入 １ μｌＴ４ＤＮＡ 连 接 酶 和 １０×Ｔ４ＤＮＡ 连 接酶缓冲液 ２ μｌ， １６ ℃过夜。取连接液 ５ μｌ， 用电转化法导 入 到 受 体 菌 ＪＭ１０９ 中 ， 取 １、１０ 和 １００ μｌ 转 化 液 按 １０－ ３、 １０－ ２、１０－１ 稀释后， 取 ２００ μｌ 涂布于含有 １００ μｇ／μｌ 氨 苄 青 霉 素 的 ＬＢ 固 体 平 板 上 ， ３７ ℃培 养 １２ ｈ， 统 计 菌 落 数 ； 剩 余 的 转化产物加到 ２ ｍｌ ＬＢ 液体培养基中， ３７ ℃过夜培养， 加 １０ ％ 的甘油存储于－ ８０ ℃。从文库中随机挑选 １００ 个克隆， 用质 粒 提取 试 剂 盒 提 取 质 粒 ＤＮＡ， 经 ＳｆｉⅠ酶 切 ， 并 在 浓 度 为 １．０ ％的琼脂糖凝胶电泳中鉴定插入 ｃＤＮＡ 片段的大小。 １．２．６ 重组克隆的测序及同源性分析。对随机挑选的质粒 ＤＮＡ 进行测序， 测序工作由上海 ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 生物公司完成。 ２ 结果与分析 ２．１ 胎盘 组 织 总 ＲＮＡ 的 提 取 采 用 Ｔｒｉｚｏｌ 试剂 氯 仿 提 取 获 得 胎 盘 组 织 的 总 ＲＮＡ， 经 蛋 白 核 酸 测 定 仪 分 析 表 明 ， Ａ２６０／Ａ２８０ 为 １．９８， 浓度为 ４８８ ｎｇ／μｌ。用浓度为 １．０ ％甲醛变性 琼脂糖凝胶电泳检测总 ＲＮＡ 质量， 结果 ２８、１８ Ｓ 条带清晰， 亮度约为 ２∶１（ 图 １） ， 说明提取的总 ＲＮＡ 质量较高 ， 可 用 于 进一步的文库构建。 ２．２ ｄｓ!ｃＤＮＡ 的合成 取 ２ μｇ 胎盘组织总 ＲＮＡ 逆转录合 成 ｃＤＮＡ 第 １ 链， 进而利用 ＬＤ"ＰＣＲ 获得 ｄｓ"ＤＮＡ， 取 １０ μｌ ＰＣＲ 产物用浓度为 １．０ ％的琼脂糖凝胶电泳检测， 结果产物 均匀分布在 ０．５～３．０ ｋｂ（ 图 ２） 。
３０Ｎ!１Ｎ!３’ Ｆ３： ５’!ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ!３’ Ｒ４： ５’!ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡ!３’
１．２ 方法 １．２．１ 胎盘组织总 ＲＮＡ 的提取。称取 １００ ｍｇ 胎盘组 织 放 入预冷的匀浆器中， 加入 １ ｍｌ ｔｒｉｚｏｌ， 匀浆后， 室温放置 １０ ｍｉｎ， ４ ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ、离心 １０ ｍｉｎ， 取上清 液 至 新 管 并加 入 ２００ μｌ 氯仿抽提 ２ 次。取抽提后的无机相用等体积的异丙醇沉 淀 ， 用 浓 度 为 ７０ ％的 乙 醇 漂 洗 沉 淀 ， 稍 晾 干 后 用 ＤＥＰＣ 处 理 ｄｄＨ２Ｏ 溶解沉淀。用蛋白核酸测定仪测定总 ＲＮＡ 的浓度 和纯度， 以浓度为 １．０ ％的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总 ＲＮＡ 质量。 １．２．２ ｃＤＮＡ 第 １ 链的合成。以 ２ μｇ 总 ＲＮＡ 为模板， 引物 Ｆ１、Ｒ２ 各 ２ μｌ， ＤＥＰＣ 处理 ｄｄＨ２Ｏ 补充 至 １０ μｌ， ７０ ℃变 性 １０ ｍｉｎ 后 立 即 冰 上 冷 却 ２ ｍｉｎ， 得 到 引 物／模 板 混 合 物 。 在 Ｍ!ＭＬＶ 逆转录酶的作用下， 合成 ｃＤＮＡ 第 １ 链。反应体系 为： １０ μｌ 上述混合物， ５×Ｍ!ＭＬＶ 缓冲液 ４ μｌ， ｄＮＴＰ．ｍｉｘ （ 浓 度 为 １０ ｍｍｏｌ／Ｌ） １ μｌ， ＲＮａｓｅ 抑 制 剂 ０．５ μｌ， Ｍ!ＭＬＶ １ μｌ， ＤＥＰＣ 水补至 ２０ μｌ。４２ ℃温育 １ ｈ， 然后 ７５ ℃温育 １５ ｍｉｎ， 冰上冷却 ３ ｍｉｎ， 合成 ｃＤＮＡ 第 １ 链。 １．２．３ ｃＤＮＡ 第 ２ 链 的 合 成 。ＰＣＲ 反 应 体 系 ： ５ μｌ１０×缓 冲 液， ｄＮＴＰ ８ μｌ， Ｆ３、Ｒ４ 引物各 ８ μｌ， ＭｇＣｌ２ ４ μｌ， ＤＮＡ 聚合酶 １ μｌ， ｃＤＮＡ 样品 ２ μｌ， ｄｄＨ２Ｏ ２８ μｌ。
安徽农业科学， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉ． Ｓｃｉ． ２００７， ３５（ ５） ： １３０５－ １３０６， １３１６
责任编辑 姜 丽 责任校对 左 佳
一种构建全长 ｃＤＮＡ 文库的方法
刘红军 １ ， 李青旺 １，２ ＊， 吴淑云 １， 韩增胜 １， 刘智华 １， 李文烨 １
（ １．西北农林科技大学动物科技学院， 陕西杨凌 ７１２１００； ２．燕山大学 环境与化学工程学院生物工程系， 河北秦皇岛 ０６６００４）
２．３ ｃＤＮＡ 质粒文库的构建及质量鉴定 计数每个平板的 菌落数分别为 ９、６３ 和 ５７３ 个， 根据公式： 文库容量＝菌落 数×稀释倍数×１００， 计算得 ３ 种稀释度测定的文库容量分别 为 ９×１０５、６．３×１０５ 和 ５．７３×１０５ 个／μｇ ｄｓ"ｃＤＮＡ， 文库的平均容 量为： ７．０１×１０５ 个／μｇ ｄｓ"ｃＤＮＡ。从构建的 ｃＤＮＡ 质粒文库中 随机挑选 １００ 个克隆， 提取质粒 ＤＮＡ， 通过酶切鉴定 ｃＤＮＡ 插入片段的大小和重组率， 结果发现文库中插入片段的大 小分布于 ０．５～３．０ ｋｂ， 在 １００ 个随机提取的质粒 中 仅 发 现 ４ 个质粒中未连人插入片段， 文库的重组率为 ９６ ％。部分插 入片段电泳图见图 ３。
摘要 建立了一种以 ＬＤ!ＰＣＲ 为基础的 ｃＤＮＡ 文库的快速构建方法。以人胎盘组织为材料获得总 ＲＮＡ， 利用引物 Ｆ１、Ｒ２ 在逆转录酶 Ｍ!ＭＬＶ 的作用下合成 ｃＤＮＡ 第 １ 链， 进而利用引物 Ｆ３、Ｒ４ 在 ＤＮＡ 聚合酶的作用下通过 ＬＤ!ＰＣＲ 方法合成 ｃＤＮＡ 第 ２ 链； 双链 ｃＤＮＡ 经 ＳｆｉⅠ酶切， 通过 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶连接到经相同酶切的 ＪＧ４５ 质粒载体后构建成 ｃＤＮＡ 文库， 并对文库的容量、重组率以及多样性进 行了分析。结果表明， 通过该方法构建的 ｃＤＮＡ 文库容量约为 ７．０１×ｌ０５ 个／μｇｄｓ!ｃＤＮＡ， 重组率为 ９６ ％； 对随机提取的 １００ 个克隆质粒 的插入序列进行分析， 共获得 ８０ 个不同的 ｃＤＮＡ 序列， 且未见重复序列。该法构建的 ｃＤＮＡ 质粒文库具有快速、简单的特点， 构建的 文库质量符合要求， 可用于大规模的基因分析。 关键词 全长 ｃＤＮＡ 文库； 长距离 ＰＣＲ； 构建文库方法 中图分类号 Ｑ５０１ 文献标识码 Ａ 文章编号 ０５１７－ ６６１１（ ２００７） ０５－ ０１３０５－ ０２
Ｒ２： ５’!ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ !ｄ（ Ｔ）
基金项目 作者简介 收稿日期
河北省秦皇岛科技局转基因动物生产基因工程药物研究项
目（ Ｄ０８） 。 刘 红军（ １９７４－ ） ， 男， 河南 汝州 人， 硕 士研 究生， 研 究方 向： 动 物生殖生理与调控技术。＊ 通讯作者， 教授， 博士生导师。 ２００６! ０９! １４
ＰＣＲ 程序设置： ９５ ℃预变性 １ ｍｉｎ； ９５ ℃变性 １５ ｓ， ６８ ℃ 复性 １ ｍｉｎ， ６８ ℃延伸 ６ ｍｉｎ， 进行 ２０ 个循环； ４ ℃保温 ３０ ｍｉｎ。 扩增产物用浓度为 １．０ ％的琼脂糖凝胶电泳鉴定合成的 ｄｓ! ｃＤＮＡ 的大小。 １．２．４ ＰＣＲ 产物的纯化。取 ５０ μｌ ＬＤ!ＰＣＲ 产物， 加入 ２ μｌ 蛋白酶 Ｋ （ 浓度为 ２０ μｇ／μｌ） ， 瞬时离心混匀， ４５ ℃孵育 ２０
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒ ａｒ ｙ Ｃｏｎｓｔｒ ｕｃｔｉｏｎ ＬＩＵ Ｈｏｎｇ!ｊｕｎ ｅｔ ａｌ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆．Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙａｎｇｌｉｎｇ， Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００） Ａｂｓｔｒ ａｃｔ Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｌｏｎｇ!ｄｉｓｔａｎｃｅ ＰＣＲ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｌａｃｅｎｔａ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｃＤＮＡ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＲＴ!ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｅｌｐ ｏｆ Ｍ!ＭＬＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｅｎｚｙｍｅ． Ｔｈｅｎ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ （ｄｓ!ｃＤＮＡ） ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ＳｆｉⅠ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＬＤ!ＰＣＲ （Ｌｏｎｇ!ｄｉｓｔａｎｃｅ!ＰＣＲ） ａｎｄ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ＪＧ４５ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｓｆｉ Ｉ． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ａｎｄ ｔｈｅｎ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ． Ｔｈｅｎ ｑｕａｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ７．０１×１０５ ｃｌｏｎｅｓ ｐｅｒ μｇ ｄｓ!ｃＤＮＡ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒａｔｅ ｏｆ ９６％． Ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ８０ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｓ， ｎｏ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ． ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ Ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ； Ｌｏｎｇｄｉｓｔａｎｃｅ!ＰＣＲ； Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
自 ２０ 世 纪 ７０ 年 代 中 期 首 例 ｃＤＮＡ 克 隆 问 世 以 来 ， 已 经 发 展 了 许多 旨 在 提 高 ｃＤＮＡ 合 成 效 率 和 长 度 的 方 法 ， 并 对载体系统进行了大量改进。大多数 ｃＤＮＡ 文库的构建利 用的是 λ噬菌体载体系统， 尽管该系统在载体的设计方面 非常成熟， 然而， 该系统构建过程中同位素对研究人员造成 的危害以及构建文库的周期长、成本高等， 限制了其实际应 用 价 值 。 传 统 ｃＤＮＡ 文 库 构 建 方 法 由 于 反 转 录 能 力 差 ， ｃＤＮＡ 内切酶位点保护不彻底和非 ｃＤＮＡ 片断的插入， 导致 了文库中克隆片断短、全长率低和无效克隆多， 已经不能适 应 目 前 大 规 模 、高 通 量 、高 效 的 功 能 基 因 组 研 究 需 要 。因 此 ， 寻找一种新的、快速、高效的构建全长 ｃＤＮＡ 的文库方法具 有重要的现实和经济意义［１］。为此， 笔者以人胎盘组织为材 料， 研究了一种以 ＬＤ!ＰＣＲ 为基础的简单快速且相对高效 的构建全长 ｃＤＮＡ 文库的方法。 １ 材料与方法 １．１ 材料 人胎盘组织， ＪＧ４５ 质粒和 Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ 菌株， 由 西北农林科技大学动物科技学院实验室保存； Ｍ!ＭＬＶ 反转 录酶， ＳｆｉⅠ限制性内切酶， Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ 聚合酶， Ｔ４ ｌｉｇａｓｅ 及 ＤＥＰＣ， 购自大连宝生物公司； 质粒小量快速提取试剂盒， ＰＣＲ 产 物 纯 化 试 剂 盒 ， 购 自 Ｂｉｏ!Ｄｅｖ 公 司 ； Ｔｒｉｚｏｌ， 购 自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公 司 ； 引物 合 成 和 测 序 ， 由 上 海 ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 生 物 公 司公司完成； 其余试剂均为国产分析纯。引物序列为：
１３０６
安徽农业科学
２０源自文库７ 年
ｍｉｎ， 用 ｄｄＨ２Ｏ 补至 １００ μｌ， 等体积酚／氯仿抽提， 无水乙醇沉 淀 ， 沉 淀 溶 解 于 适 量 的 ｄｄＨ２Ｏ 中 ， 并 用 Ａ２６０／ Ａ２８０ 计 算 ｄｓ" ｃＤＮＡ 的浓度， 调整其终浓度为 ０．１ μｇ／μｌ。 １．２．５ ｃＤＮＡ 文库的构建及鉴定。取 ２ μｌ ｄｓ"ｃＤＮＡ， 按 ｃＤＮＡ 与载 体 摩 尔 比 为 ３∶１ 加 入 经 同样 酶 切 的 质 粒 载 体 ＪＧ４５， 在 ２０ μｌ 连接 体 系 中 加 入 １ μｌＴ４ＤＮＡ 连 接 酶 和 １０×Ｔ４ＤＮＡ 连 接酶缓冲液 ２ μｌ， １６ ℃过夜。取连接液 ５ μｌ， 用电转化法导 入 到 受 体 菌 ＪＭ１０９ 中 ， 取 １、１０ 和 １００ μｌ 转 化 液 按 １０－ ３、 １０－ ２、１０－１ 稀释后， 取 ２００ μｌ 涂布于含有 １００ μｇ／μｌ 氨 苄 青 霉 素 的 ＬＢ 固 体 平 板 上 ， ３７ ℃培 养 １２ ｈ， 统 计 菌 落 数 ； 剩 余 的 转化产物加到 ２ ｍｌ ＬＢ 液体培养基中， ３７ ℃过夜培养， 加 １０ ％ 的甘油存储于－ ８０ ℃。从文库中随机挑选 １００ 个克隆， 用质 粒 提取 试 剂 盒 提 取 质 粒 ＤＮＡ， 经 ＳｆｉⅠ酶 切 ， 并 在 浓 度 为 １．０ ％的琼脂糖凝胶电泳中鉴定插入 ｃＤＮＡ 片段的大小。 １．２．６ 重组克隆的测序及同源性分析。对随机挑选的质粒 ＤＮＡ 进行测序， 测序工作由上海 ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 生物公司完成。 ２ 结果与分析 ２．１ 胎盘 组 织 总 ＲＮＡ 的 提 取 采 用 Ｔｒｉｚｏｌ 试剂 氯 仿 提 取 获 得 胎 盘 组 织 的 总 ＲＮＡ， 经 蛋 白 核 酸 测 定 仪 分 析 表 明 ， Ａ２６０／Ａ２８０ 为 １．９８， 浓度为 ４８８ ｎｇ／μｌ。用浓度为 １．０ ％甲醛变性 琼脂糖凝胶电泳检测总 ＲＮＡ 质量， 结果 ２８、１８ Ｓ 条带清晰， 亮度约为 ２∶１（ 图 １） ， 说明提取的总 ＲＮＡ 质量较高 ， 可 用 于 进一步的文库构建。 ２．２ ｄｓ!ｃＤＮＡ 的合成 取 ２ μｇ 胎盘组织总 ＲＮＡ 逆转录合 成 ｃＤＮＡ 第 １ 链， 进而利用 ＬＤ"ＰＣＲ 获得 ｄｓ"ＤＮＡ， 取 １０ μｌ ＰＣＲ 产物用浓度为 １．０ ％的琼脂糖凝胶电泳检测， 结果产物 均匀分布在 ０．５～３．０ ｋｂ（ 图 ２） 。
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１．２ 方法 １．２．１ 胎盘组织总 ＲＮＡ 的提取。称取 １００ ｍｇ 胎盘组 织 放 入预冷的匀浆器中， 加入 １ ｍｌ ｔｒｉｚｏｌ， 匀浆后， 室温放置 １０ ｍｉｎ， ４ ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ、离心 １０ ｍｉｎ， 取上清 液 至 新 管 并加 入 ２００ μｌ 氯仿抽提 ２ 次。取抽提后的无机相用等体积的异丙醇沉 淀 ， 用 浓 度 为 ７０ ％的 乙 醇 漂 洗 沉 淀 ， 稍 晾 干 后 用 ＤＥＰＣ 处 理 ｄｄＨ２Ｏ 溶解沉淀。用蛋白核酸测定仪测定总 ＲＮＡ 的浓度 和纯度， 以浓度为 １．０ ％的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总 ＲＮＡ 质量。 １．２．２ ｃＤＮＡ 第 １ 链的合成。以 ２ μｇ 总 ＲＮＡ 为模板， 引物 Ｆ１、Ｒ２ 各 ２ μｌ， ＤＥＰＣ 处理 ｄｄＨ２Ｏ 补充 至 １０ μｌ， ７０ ℃变 性 １０ ｍｉｎ 后 立 即 冰 上 冷 却 ２ ｍｉｎ， 得 到 引 物／模 板 混 合 物 。 在 Ｍ!ＭＬＶ 逆转录酶的作用下， 合成 ｃＤＮＡ 第 １ 链。反应体系 为： １０ μｌ 上述混合物， ５×Ｍ!ＭＬＶ 缓冲液 ４ μｌ， ｄＮＴＰ．ｍｉｘ （ 浓 度 为 １０ ｍｍｏｌ／Ｌ） １ μｌ， ＲＮａｓｅ 抑 制 剂 ０．５ μｌ， Ｍ!ＭＬＶ １ μｌ， ＤＥＰＣ 水补至 ２０ μｌ。４２ ℃温育 １ ｈ， 然后 ７５ ℃温育 １５ ｍｉｎ， 冰上冷却 ３ ｍｉｎ， 合成 ｃＤＮＡ 第 １ 链。 １．２．３ ｃＤＮＡ 第 ２ 链 的 合 成 。ＰＣＲ 反 应 体 系 ： ５ μｌ１０×缓 冲 液， ｄＮＴＰ ８ μｌ， Ｆ３、Ｒ４ 引物各 ８ μｌ， ＭｇＣｌ２ ４ μｌ， ＤＮＡ 聚合酶 １ μｌ， ｃＤＮＡ 样品 ２ μｌ， ｄｄＨ２Ｏ ２８ μｌ。
安徽农业科学， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉ． Ｓｃｉ． ２００７， ３５（ ５） ： １３０５－ １３０６， １３１６
责任编辑 姜 丽 责任校对 左 佳
一种构建全长 ｃＤＮＡ 文库的方法
刘红军 １ ， 李青旺 １，２ ＊， 吴淑云 １， 韩增胜 １， 刘智华 １， 李文烨 １
（ １．西北农林科技大学动物科技学院， 陕西杨凌 ７１２１００； ２．燕山大学 环境与化学工程学院生物工程系， 河北秦皇岛 ０６６００４）
２．３ ｃＤＮＡ 质粒文库的构建及质量鉴定 计数每个平板的 菌落数分别为 ９、６３ 和 ５７３ 个， 根据公式： 文库容量＝菌落 数×稀释倍数×１００， 计算得 ３ 种稀释度测定的文库容量分别 为 ９×１０５、６．３×１０５ 和 ５．７３×１０５ 个／μｇ ｄｓ"ｃＤＮＡ， 文库的平均容 量为： ７．０１×１０５ 个／μｇ ｄｓ"ｃＤＮＡ。从构建的 ｃＤＮＡ 质粒文库中 随机挑选 １００ 个克隆， 提取质粒 ＤＮＡ， 通过酶切鉴定 ｃＤＮＡ 插入片段的大小和重组率， 结果发现文库中插入片段的大 小分布于 ０．５～３．０ ｋｂ， 在 １００ 个随机提取的质粒 中 仅 发 现 ４ 个质粒中未连人插入片段， 文库的重组率为 ９６ ％。部分插 入片段电泳图见图 ３。
摘要 建立了一种以 ＬＤ!ＰＣＲ 为基础的 ｃＤＮＡ 文库的快速构建方法。以人胎盘组织为材料获得总 ＲＮＡ， 利用引物 Ｆ１、Ｒ２ 在逆转录酶 Ｍ!ＭＬＶ 的作用下合成 ｃＤＮＡ 第 １ 链， 进而利用引物 Ｆ３、Ｒ４ 在 ＤＮＡ 聚合酶的作用下通过 ＬＤ!ＰＣＲ 方法合成 ｃＤＮＡ 第 ２ 链； 双链 ｃＤＮＡ 经 ＳｆｉⅠ酶切， 通过 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶连接到经相同酶切的 ＪＧ４５ 质粒载体后构建成 ｃＤＮＡ 文库， 并对文库的容量、重组率以及多样性进 行了分析。结果表明， 通过该方法构建的 ｃＤＮＡ 文库容量约为 ７．０１×ｌ０５ 个／μｇｄｓ!ｃＤＮＡ， 重组率为 ９６ ％； 对随机提取的 １００ 个克隆质粒 的插入序列进行分析， 共获得 ８０ 个不同的 ｃＤＮＡ 序列， 且未见重复序列。该法构建的 ｃＤＮＡ 质粒文库具有快速、简单的特点， 构建的 文库质量符合要求， 可用于大规模的基因分析。 关键词 全长 ｃＤＮＡ 文库； 长距离 ＰＣＲ； 构建文库方法 中图分类号 Ｑ５０１ 文献标识码 Ａ 文章编号 ０５１７－ ６６１１（ ２００７） ０５－ ０１３０５－ ０２