微生物的生理生化反应

微生物的生理生化反应
摘要：了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法;掌握淀粉水解试验、糖发酵、MR、VP的原理和方法；各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。

以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。

关键词：淀粉水解试验、糖发酵试验、甲基红试验、伏普实验
引言：
不同种类的微生物有着不同的代谢类型，例如对一些物质的分解能力及分解代谢的产物的不同反映出他们不同的生理特征，这些特征可以用来对不同种类微生物进行鉴定和分类。

因此可以对微生物的不同生化反应进行试验，以此证明微生物生理特征的多样性，证明微生物分类鉴别的依据。

生理生化试验相比其他鉴别方法而言相对简便、快捷、经济实用，在一般的实验室中都可以进行，因此在微生物种类的初步鉴别中被广泛使用
1.材料与方法
1.1试验时间 2011年11月14日山东农业大学 9#楼522实验室进行
1.2实验材料
菌种：大肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌
溶液或试剂：卢戈氏碘液、溴甲酚紫、甲基红、伏普、NaOH溶液、NaCI溶液、
5%α-萘酚溶液
培养基：固体淀粉培养基、蛋白胨水溶液培养基、糖发酵培养基试管、乳糖发酵培养基试管
仪器：无菌平板、无菌试管、接种环、棉塞、试管架、酒精灯、火柴、PH试纸。

移液器、枪头、报纸、橡皮筋、记号笔、称量纸、玻璃棒、电子天平、电磁炉等
1.3试验方法
1.3.1淀粉水解试验
（1）将固体培养基熔化后冷却至50℃左右，无菌操作成平板；
（2）用记号笔在平板底部划成3部分；
（3）将大肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别在3部分写上菌名；
（4）将平板倒置在37℃恒温箱中培养24h；
（5）观察各种细菌的生长状况，打开平板盖子，滴入少量卢戈式碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。

1.3.2糖发酵试验
（1）用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名；
（2）取葡萄糖发酵培养基4支，分别接入大肠杆菌、普通变形菌，枯草芽孢杆菌,第4支不接种，作为对照。

另取乳糖发酵培养基试管4支，同样分别接入大肠杆菌、普通变形菌，第三支不接种，作为对照。

接种后，轻轻摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。

（3）将接过种和作为对照的8支试管均置于37℃中培养24~48h。

（4）观察各试管颜色变化及德汉式小管中有无气泡。

1.3.3甲基红试验
培养48h后，将1支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。

1.3.4伏一普试验(V．P．试验)
培养24h，将另1支葡萄糖蛋白胨水溶液加入5 ~10滴40％KOH，然后再加入等量的5％a-萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱中保温15 ~30min，以加快反应速度。

若培养物呈现红色，为伏—普反应阳性。

2结果与分析
2.1试验结果
2.1.2糖发酵试验
2.1.3 MR和V—P试验
2.2试验分析
2.2.1 淀粉水解实验在这个实验中可以明显观察到枯草芽孢杆菌的透明圈，但这个实验中应该要注意几个方面的问题，否则很容易造成试验的失败。

一、制备培养基时要注意称量的准确性，药品的量不能出现偏差，否则实验结果会有一些误差；二、当淀粉培养基冷却至50℃，温度不能太低，冷却的温度太低会造成在倒培养基的过程中，培养基凝结成块，致使培养基表面不平，影响实验结果；冷却温度太高又容易烫伤，所以，要注意冷却的温度；三、在接种的时候，要注意无菌操作，移液器要在酒精灯的无菌操作圈的范围内，在进行接种的时候，要将菌液混合均匀，让菌在平板上均匀地生长，便于实验结果的观察。

2.2.2 糖发酵试验
（1）葡萄糖发酵试验在这个实验中，有许多因素会造成实验结果的误差。

一、制备葡萄糖发酵培养基时，首先要制备蛋白胨水培养基，并且要将培养基的PH值调整到7.6,（这个需要用精确PH试纸进行调试），并且要在每个试管中放置小玻璃管，这点千万不能忽略，否则就看不到气泡产生的明显现象了；二、将糖和蛋白冻要分开灭菌，葡萄糖要在112℃中灭菌30min ，而蛋白胨要在121℃中灭菌 20min ；三、将葡萄糖移入蛋白胨水培养基中时一定要注意无菌操作，每个试管中的糖溶液的量要一样，所以在使用移液器时就要准确移取，不能出现失误，否则会造成试验失败；四，当培养基制备好后，影响实验结果的因素就成了后续操作的准确性了，将菌液加入培养基时，不但要注意无菌操作，更要注意操作的规范性，在操作时要在超净台上操作不能离开，否则很容易造成一些不必要的污染；四、培养的时候一定要注意培养时间一定要充足，否则，菌还没有达到生长期或是已经到达衰亡期后，就没办法判断菌种的生理生化性质了。

（2）乳糖发酵试验在这个实验中，我们都没有做出试验结果，具体的原因讨论如下，一、培养基的制备问题。

首先要从称量操作开始，称量一定要准确，可能是在称量过程中有部分化学药剂的量不够准确，致使结果出现偏差；其次在PH的调节上出现了问题，使用的可能是KOH 溶液，而非我们平时使用的NaOH 溶液，这就可能会使钾离子对菌种的生长造成一定的影响，抑制菌的生长或者抑制菌对培养基的分解效果，从而使菌在培养基中不出现显色和产气反应；再就是在将乳糖溶液移入蛋白胨水培养基的过程中出现操作失误，比如，无菌操作不够规范，致使一些其他的菌进入培养基中，干扰了需要观察的菌的生长情况；还有就是加入的乳糖溶液的量不够，使菌种在分解完乳糖后不能够产生很明显的现象；二、将菌液移入培养基的过程中可能出现了污染，移液器可能有一段时间离开了酒精灯的无菌圈的范围，可能造成污染，移液枪头盒出现松动的时候，移液枪也可能离开了无菌圈，从而导致实验结果的误差；三、灭菌的过程中可能将培养基放错了灭菌锅，导致有些蛋白质的活性被改变了，从而改变了实验结果。

2.2.3 MR和V—P试验做这两个实验的过程中，很容易会出现误差，所以不但要在观察的过程中、培养的过程中以及制备培养基的过程中都要严格按照操作步骤进行。

一、制备培养基的过程中要注意称量的问题，还有培养基的PH值一定要调到规定的范围之内，否则很容易在观察的时候出现误差，一些不耐酸的菌会不进行生长，从而干扰我们的观察；二、在培养过程中，由于培养时间长，存在多种影响因素，比如培养温度的改变，培养基的营养成分的耗尽等，均会对菌的生长造成影响；三、在观察过程中，
试管中存在某些沉淀和覆盖物，影响试剂颜色的观察；四、在接种时会出现两种情况，情况一是无菌操作不规范，离开了无菌圈；情况二是在菌的接种过程中，接种环距离酒精灯无菌圈太近，造成部分菌的死亡，接种量不能满足要求。

参考文献：【1】沈萍，范秀荣.微生物学实验.北京.北京高等教育出版社，2007:116-123。