果胶酶产生菌的筛选及其条件优化2

实验序号实验7 实验名称特定产物工业生产菌种发酵及应用性质研究（一）实验时间2011.11.15--12.15 实验室118
一、实验目的：
1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；
2、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会运用微生物生态知识分离产酶微生物；
3、掌握果胶酶活性测定的原理，学会果胶酶活性的测定方法；
4、了解酶学性质的研究。

二、实验原理
1、果胶质：果胶是植物中的一种酸性多糖物质，它通常为白色至淡黄色粉末，稍带酸味，具有水溶性，工业上即可分离，其分子量约5万——30万，主要存在于植物的细胞壁和细胞内层，为内部细胞的支撑物质。

果胶质是一类高分子碳水化合物，普遍存在与高等植物的细胞壁及细胞壁间作为结构物质。

2、果胶酶：分解果胶的一个多酶复合物，通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸酶。

通过它们的联合作用使果胶质得以完全分解。

天然的果胶质在原果胶酶作用下，转化成水可溶性的果胶；果胶被果胶甲酯水解酶催化去掉甲酯基团，生成果胶酸；果胶酸经果胶酸水解酶类和果胶酸裂合酶类降解生成半乳糖醛酸。

细菌、放线菌、酵母菌和霉菌都可以发酵产生果胶酶，但是目前商品果胶酶主要来自于霉菌。

果胶酶主要用于果胶的分解，在水果的加工、葡萄酒的生产、麻类脱胶和饲料方面。

3、果胶酶的酶活测定方法：
①、粘度降低法：利用粘度计测量一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。

②、脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。

③、次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。

④、还原糖法（DNS法）：测定在一定反应时间内，水解果胶产生的还原糖的量。

根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸是一种还原糖，与3，5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。

4、影响微生物发酵的因素有很多；
①、培养基的成分（营养物质及其浓度）例如：碳源的种类、氮源的种类、碳源的浓度、氮源的浓度、无机盐、水含量等；
②、菌种接种的量；
③、发酵条件：温度、PH、溶解氧等；
④、附加条件：诱导物、表面活性剂等
（5）、酶催化反应的进行也受到多方面因素的影响：底物浓度、酶浓度、温度、PH、激活剂、抑制剂。

（6）、果胶酶的最适催化PH为酸性，在3.5左右，而DNS的显色PH为碱性。

三、实验设备及材料：
1、实验设备：天平、灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、电磁炉、恒温水浴锅、计时器（精确到秒）、分光光度计、离心机、烘箱、PH计数器。

2、实验用具：烧杯、三角瓶、试管、移液枪（枪头）、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵、试管架、玻璃棒、纱布、绳子、离心管、比色皿、培养皿。

3、实验试剂：
①、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸15.652克，柠檬酸钠7.5克，溶解定容至1000ml，用0.1M NaOH或0.1M HCl调节PH至3.0。

②、底物——0.25%果胶溶液：称取0.25g果胶，用PH=3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解，在电磁炉上加热至完全溶解，用缓冲液定容至100mL，储存于
4 ℃，7天内有效。

③、DNS试剂：称取酒石酸钾钠182.0g，溶解于500mL水中，加热（不超过50℃），于热溶液中依次加入2，5-二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21.0g，苯酚5.0g，搅拌均匀至溶解，冷却后定容1000mL，储存于棕色瓶中，室温保存，7-10天后过滤使用。

4、实验材料：从周围环境采集的土样或腐烂的水果上的霉菌。

5、培养基：
①、基本培养基；
成分及条
件
果胶磷酸二氢钠蛋白胨琼脂pH
含量及水
平
1% 0.5% 1% 2.0% 4.5
②、分离培养基；
成分及条件果胶磷酸二氢钠琼脂pH
含量及水平0.5% 0.5% 2.0% 4.5
③、发酵培养基；
成分及条件果胶磷酸二氢钠蛋白胨pH
含量及水平1% 0.5% 1% 4.5
④、种子培养基；
成分及条件麸皮橘子粉硫酸铵葡萄糖磷酸二氢
钾
pH
含量及水
平
3.0% 2.0% 0.5% 1% 0.1%
4.5
⑤、固体发酵培养基；
成分及条
件
麸皮橘子粉硫酸铵葡萄糖水
含量及水
平
10g 2.5g 0.1g 0.125g 15mL
四、实验步骤
（一）、半乳糖醛酸标准曲线的绘制；
1、先配制一系列浓度不同的标准曲线溶液，用选定的显色剂进行显色。

（1）、精确称取0.100g 半乳糖醛酸，用缓冲液定容至100mL ，制得浓度为1mg/mL 的半乳糖醛酸的标准溶液。

（2）、如下表配制溶液；
半乳糖醛酸溶液体
积
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 半乳糖醛
酸
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 缓冲液
(ml)
2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 DNS(ml)
3 3 3 3 3 3 3 定容总体
积(ml)
20 20 20 20 20 20 20 OD(540n
m) 0.000 0.085 0.241 0.405 0.550 0.703 0.850
（3）、在540nm 波长的光下测定他们的吸光度A 。

（4）、以A 为横坐标，浓度c 为纵坐标，做出标准曲线。

0.511.5
00.20.40.6
0.81
标准曲线
y = 1.3623x+0.0484OD 值半乳糖醛酸浓度系列1线性 (系列1)
（二）、果胶酶产生菌的筛选分离；
1、按照上方所说的基本培养基比例称取各组分，称好后将其煮沸溶解。

2、灭菌，将煮好融化后的培养基倒入三角瓶内，用8层纱布，一层油布纸和两层
报纸包扎好后置于灭菌锅内灭菌40分钟。

3、倒平板，将灭好菌的培养基取出，趁热在超净工作台内将其倒入适量于灭过菌
的培养皿内（10ml左右），待其冷却后凝固备用。

4、接种，将采集的土样晾干（本组使用土壤，来自于腐烂柿子下方的土壤），然后
取适量在研钵中研磨细，用食指蘸取少量，在上述倒好的平板上用拇指轻搓一下，
使其均匀的洒落在平板上。

5、培养，将接种后的平板用报纸包好，将其置于恒温培养箱内培养36个小时。

6、再按照上述分离培养基配方称取各种成分并煮化后置于灭菌锅内灭菌40min，然
后倒平板，冷却凝固备用。

7、将基本培养基取出，在超净工作台内用接种针从中挑取菌在配制好的分离培养
基平板上划线分离（可以挑取不同的菌落在不同的平板上划线分离）。

8、包扎好后置于恒温培养箱内培养36个小时。

9、取出继续划线分离直到得到单一菌落为止。

10、找出周围透明圈较大的菌落作为菌种。

（三）、菌种的准备：
1、照种子培养基的比例称好各物质，并进行灭菌，冷却后待用。

2、将从步骤（三）中得到的周围透明圈较大的菌落在超净工作台中接种到种子培养基中。

（选出几个菌种就接种几瓶）
（四）、菌种的选择(我们组选择出的菌种为霉菌)：
1、配制发酵培养基（本组在菌种的选择时采用液体发酵）并灭菌，数量根据所选出的菌的数量来定（本组选出了5个菌种，所以配制了5瓶）。

2、将灭好菌的培养基取出冷却后在超净工作台内编好号（k1,k2,k3,k4,k5,）并接入对应的菌种5%。

3、在30℃的恒温摇床内培养48小时。

4取出后在超净工作台内各吸取10ml（5ml）发酵液于对应编号的离心管内在离心机内离心5min。

5、取15支试管分别标上1空、1A、1B，2空、2A、2B……5空、5A、5B，并每支试管加入1.8ml 0.25%的果胶溶液置于37℃的恒温水浴锅中预热5min。

6、取离心好的上清液分别在其数字对应的A、B试管内加入0.2ml上清液，注意，空白管不加。

7、加好后精确计时30min，当时间到时，向每支空白管内分别加入对应序号的离心管内的上清液，同时加入1ml40%的NaOH与3mlDNS试剂终止反应。

8、将所有的试管取出再沸水浴5min。

取出后流水冷却。

9、向每一支试管内加入14ml蒸馏水并震荡使其混合均匀。

10、用分光光度计在540nm的波长的光下以空白管为对照测定A,B管的反应液的
吸光度，并计算出酶活，选出产酶最高的菌种作为以后条件优化的实验菌种。

（五）、果胶酶产生菌发酵产酶条件的优化：
1、氮源的选择：（使用固体发酵）
（1）、配制固体发酵培养基3份并将氮源分别改为硫酸铵、蛋白胨、牛肉膏并按照1%的浓度替换发酵培养基中的蛋白胨；
（2）、于高压灭菌锅中灭菌40min，取出冷却后接种5%的选择出的菌种；
（3）、在30℃的恒温培养箱中培养48小时；
（4）、取出发酵完毕的培养基并各从中取出适量的一块酶曲于培养皿中在烘箱内烘干（温度不宜太高，否则会使酶失活）；
（5）、各取出烘干的酶曲称取1g于一试管中并加入19ml缓冲液将其稀释20倍后于振荡器上震荡使其混合均匀后静置澄清（注意做好标记）；
（6）、取3支离心管分别标记上“1（硫酸铵）”、“2（蛋白胨）”、“3（牛肉膏）”并加入上方对应氮源添加后发酵得到的酶曲的稀释液，然后在离心机中离心5min；
（7）取9支试管分别标记为“1空、1A、1B，2空、2A、2B，3空、3A、3B”。

并分别加入1.8ml0.25%的果胶溶液。

于37℃的恒温水浴锅中预热5min；
（8）向除了空白管以外的其他几支管加入0.2ml离心后的上清液（酶液），然后精确计时30min；
（9）向空白管内分别各加入0.2ml的酶液同时每只管个加入1ml 40%的NaOH溶液与3ml DNS试剂终止反应；
（10）、取出各管并沸水浴5min,取出后流水冷却并分别加入14ml蒸馏水后混匀；
（11）、以空白管对照用分光光度计测定540nm下的吸光度并计算酶活；
（12）、选出最佳氮源。

（1）、配制固体发酵培养基5份并将氮源浓度分别改为0.5%（1）、1.0%（2）、1.5%（3）、2%（4）、2.5%（5）替换发酵培养基中的蛋白胨；
（2）、于高压灭菌锅中灭菌40min，取出冷却后接种5%的选择出的菌种；
（3）、在30℃的恒温培养箱中培养48小时；
（4）、取出发酵完毕的培养基并各从中取出适量的一块酶曲于培养皿中在烘箱内烘干（45℃左右）；
（5）、各取出烘干的酶曲称取1g于一试管中并加入19ml缓冲液将其稀释20倍后于振荡器上震荡使其混合均匀后静置澄清（注意做好标记）；
（6）、取5支离心管分别标记上“1（0.5%）”、“2（1.0%）”、“3（1.5%）”、“4（2%）”、“5（2.5%）”并加入对应氮源浓度添加后发酵得到的酶曲的稀释液，然后在离心机中离心5min（或者用纱布过滤）；
（7）取9支试管分别标记为“1空、1A、1B，2空、2A、2B……5空、5A、5B”。

并分别加入1.8ml0.25%的果胶溶液。

于37℃的恒温水浴锅中预热5min；
（8）向除了空白管以外的其他几支管加入0.2ml离心后制得的酶液，然后精确计时30min；
（9）向空白管内分别各加入0.2ml的酶液同时每只管个加入1ml 40%的NaOH溶液与3ml DNS试剂终止反应；
（10）、取出各管并沸水浴5min,取出后流水冷却并分别加入14ml蒸馏水后混匀；
（11）、以空白管对照用分光光度计测定540nm下的吸光度并计算酶活；
（12）、选出最佳氮源浓度。

2、碳源的选择：
（1）、配制固体发酵培养基3份并将氮源分别改为果胶（1）、葡萄糖（2）、橘子粉（3）并按照1%的浓度替换发酵培养基中的碳源；
（2）、于高压灭菌锅中灭菌40min，取出冷却后接种5%的选择出的菌种；
（3）、在30℃的恒温培养箱中培养48小时；
（4）、取出发酵完毕的培养基并各从中取出适量的一块酶曲于培养皿中在烘箱内烘干（温度不宜太高，否则会使酶失活）；
（5）、各取出烘干的酶曲称取1g于一试管中并加入19ml缓冲液将其稀释20倍后于振荡器上震荡使其混合均匀后静置澄清（注意做好标记）；
（6）、取3支离心管分别标记上“1（果胶）”、“2（葡萄糖）”、“3（橘子粉）”并加入上方对应氮源添加后发酵得到的酶曲的稀释液，然后在离心机中离心5min；
（7）取9支试管分别标记为“1空、1A、1B，2空、2A、2B，3空、3A、3B”。

并分别加入1.8ml 0.25%的果胶溶液。

于37℃的恒温水浴锅中预热5min；
（8）向除了空白管以外的其他几支管加入0.2ml离心后的上清液（酶液），然后精确计时30min；
（9）向空白管内分别各加入0.2ml的酶液同时每只管个加入1ml 40%的NaOH溶液与3ml DNS试剂终止反应；
（10）、取出各管并沸水浴5min,取出后流水冷却并分别加入14ml蒸馏水后在振荡器上震荡使其混合均匀；
（11）、以空白管对照用分光光度计测定540nm下的吸光度并计算酶活；
（12）、选出最佳碳源。

（1）、配制固体发酵培养基5份并将碳源浓度分别改为0 %（1）、0.5%（2）、1.0%（3）、2.0%（4）、3.0%（5）替换发酵培养基中的碳源；
（2）、于高压灭菌锅中灭菌40min，取出冷却后接种5%的选择出的菌种；
（3）、在30℃的恒温培养箱中培养48小时；
（4）、取出发酵完毕的培养基并各从中取出适量的一块酶曲于培养皿中在烘箱内烘干（45℃左右）；
（5）、各取出烘干的酶曲称取1g于一试管中并加入19ml缓冲液将其稀释20倍后于振荡器上震荡使其混合均匀后静置澄清（注意做好标记）；
（6）、取5支离心管分别标记上“1（0%）”、“2（0.5%）”、“3（1.0%）”、“4（2%）”、“5（3%）”并加入对应氮源浓度添加后发酵得到的酶曲的稀释液，然后在离心机中离心5min（或者用纱布过滤）；
（7）取9支试管分别标记为“1空、1A、1B，2空、2A、2B……5空、5A、5B”。

并分别加入1.8ml0.25%的果胶溶液。

于37℃的恒温水浴锅中预热5min；
（8）向除了空白管以外的其他几支管加入0.2ml离心后制得的酶液，然后精确计时30min；
（9）向空白管内分别各加入0.2ml的酶液同时每只管个加入1ml 40%的NaOH溶液与3ml DNS试剂终止反应；
（10）、取出各管并沸水浴5min,取出后流水冷却并分别加入14ml蒸馏水后混匀；
（11）、以空白管对照用分光光度计测定540nm下的吸光度并计算酶活；
（12）、选出最佳碳源浓度。

4、培养基含水量的优化：
（1）、配制固体发酵培养基5份并将含水量分别改为50 %（1）、55%（2）、60%（3）、65%（4）、70%（5）其他组分的比例不变；
（2）、于高压灭菌锅中灭菌40min，取出冷却后接种5%的选择出的菌种；
（3）、在30℃的恒温培养箱中培养48小时；
（4）、取出发酵完毕的培养基并各从中取出适量的一块酶曲于培养皿中在烘箱内烘干（45℃左右）；
（5）、各取出烘干的酶曲称取1g于一试管中并加入19ml缓冲液将其稀释20倍后于振荡器上震荡使其混合均匀后静置澄清（注意做好标记）；
（6）、取5支离心管分别标记上“1（50%）”、“2（55%）”、“3（60%）”、“4（65%）”、“5（70%）”并加入对应氮源浓度添加后发酵得到的酶曲的稀释液，然后在离心机中离心5min（或者用纱布过滤）；
（7）取9支试管分别标记为“1空、1A、1B，2空、2A、2B……5空、5A、5B”。

并分别加入1.8ml0.25%的果胶溶液。

于37℃的恒温水浴锅中预热5min；
（8）向除了空白管以外的其他几支管加入0.2ml离心后制得的酶液，然后精确计时30min；
（9）向空白管内分别各加入0.2ml的酶液同时每只管个加入1ml 40%的NaOH溶液与3ml DNS试剂终止反应；
（10）、取出各管并沸水浴5min,取出后流水冷却并分别加入14ml蒸馏水后混匀；
（11）、以空白管对照用分光光度计测定540nm下的吸光度并计算酶活；
（12）、选出产酶最佳的含水量。

5、接种量对产酶的影响：
（1）、配制固体发酵培养基5份，其组分不变；
（2）、于高压灭菌锅中灭菌40min，取出冷却后分别接种4%（1）、5%（2）、6%（3）、7%（4）、8%（5）的选择出的菌种；
（3）、在30℃的恒温培养箱中培养48小时；
（4）、取出发酵完毕的培养基并各从中取出适量的一块酶曲于培养皿中在烘箱内烘干（45℃左右）；
（5）、各取出烘干的酶曲称取1g于一试管中并加入19ml缓冲液将其稀释20倍后于振荡器上震荡使其混合均匀后静置澄清（注意做好标记）；
（6）、取5支离心管分别标记上“1（4%）”、“2（5%）”、“3（6%）”、“4（7%）”、“5（8%）”并加入对应氮源浓度添加后发酵得到的酶曲的稀释液，然后在离心机中离心5min（或者用纱布过滤）；
（7）取9支试管分别标记为“1空、1A、1B，2空、2A、2B……5空、5A、5B”。

并分别加入1.8ml0.25%的果胶溶液。

于37℃的恒温水浴锅中预热5min；
（8）向除了空白管以外的其他几支管加入0.2ml离心后制得的酶液，然后精确计时30min；
（9）向空白管内分别各加入0.2ml的酶液同时每只管个加入1ml 40%的NaOH溶液与3ml DNS试剂终止反应；
（10）、取出各管并沸水浴5min,取出后流水冷却并分别加入14ml蒸馏水后混匀；
（11）、以空白管对照用分光光度计测定540nm下的吸光度并计算酶活；
（12）、选出产酶最高的培养基对应的接种量。

6、发酵时间对产酶的影响：
（1）、配制固体发酵培养基5份，其组分不变；
（2）、于高压灭菌锅中灭菌40min，取出冷却后分别接种5%的选择出的菌种并作好标记：36h(1),48h(2),60h(3),72h(4),84(5)；
（3）、1号在30℃的恒温培养箱中培养36小时后取出取出适量的一块酶曲于培养皿中在烘箱内烘干，然后根据前面各个条件优化中测定酶活的方法来测定酶活；
（4）、2号在30℃的恒温培养箱中培养48小时后取出取出适量的一块酶曲于培养皿中在烘箱内烘干并测定酶活；
（5）、3号在30℃的恒温培养箱中培养60小时后取出取出适量的一块酶曲于培养皿中在烘箱内烘干并测定酶活；
（6）、4号在30℃的恒温培养箱中培养72小时后取出取出适量的一块酶曲于培养皿中在烘箱内烘干并测定酶活；
（7）、5号在30℃的恒温培养箱中培养84小时后取出取出适量的一块酶曲于培养皿中在烘箱内烘干并测定酶活；
（8）选出最适的发酵时间。

7、发酵温度的优化：
（1）、配制固体发酵培养基3份，其各组分比例均不变；
（2）、于高压灭菌锅中灭菌40min，取出冷却后接种5%的选择出的菌种并作标记：“30℃（1）”，“37℃（2）”，“45℃（3）”；
（3）、分别将各个瓶放在其标记对应的30℃、37℃、45℃的恒温培养箱中培养48小时；
（4）、取出发酵完毕的培养基并各从中取出适量的一块酶曲于培养皿中在烘箱内烘干；
（5）、各取出烘干的酶曲称取1g于一试管中并加入19ml缓冲液将其稀释20倍后于振荡器上震荡使其混合均匀后静置澄清（注意做好标记）；
（6）、取3支离心管分别标记上“1（30℃）”、“2（37℃）”、“3（45℃）”并加入上方对应氮源添加后发酵得到的酶曲的稀释液，然后在离心机中离心5min；
（7）取9支试管分别标记为“1空、1A、1B，2空、2A、2B，3空、3A、3B”。

并分别加入1.8ml 0.25%的果胶溶液。

于37℃的恒温水浴锅中预热5min；
（8）向除了空白管以外的其他几支管加入0.2ml离心后的上清液（酶液），然后精确计时30min；
（9）向空白管内分别各加入0.2ml的酶液同时每只管个加入1ml 40%的NaOH溶液与3ml DNS试剂终止反应；
（10）、取出各管并沸水浴5min,取出后流水冷却并分别加入14ml蒸馏水后在振荡器上震荡使其混合均匀；
（11）、以空白管对照用分光光度计测定540nm下的吸光度并计算酶活；（12）、选出最佳碳源。

8、pH对产酶的影响：
（1）、配制7瓶液体发酵培养基（由于固体发酵培养基在做pH的优化是pH不容易条件，所以本组在选择最适发酵产酶的pH时采用液体发酵）并灭菌；
（2）、将灭好菌的培养基取出冷却后在超净工作台内编好号“1（pH=3.0）,2(pH=3.5), 3(pH=4.0),4(pH=4.5),5(pH=5.0),6(pH=5.5),7(pH=6.0)并接入选出的菌种5%
（3）、在30℃的恒温摇床内培养48小时，取7支试管并编号“1、2、3、4、5、6、7“。

（4）、取出发酵液在超净工作台内各吸取10ml（5ml）发酵液于对应编号的离心管内并在离心机内离心5min。

（5）、取21支试管分别标上1空、1A、1B，2空、2A、2B……7空、7A、7B，并在每支试管内加入1.8ml 0.25%的果胶溶液置于37℃的恒温水浴锅中预热5min。

（6）、取离心好的上清液（酶液）分别在其数字对应的A、B试管内加入0.2ml 上清液，注意，空白管不加。

（7）、加好后精确计时30min，当时间到时，向每支空白管内分别加入对应序号的离心管内的上清液（酶液），同时加入1ml 40%的NaOH与3mlDNS试剂终止反应。

（8）、将所有的试管取出再沸水浴5min。

取出后流水冷却。

（9）、向每一支试管内加入14ml蒸馏水并震荡使其混合均匀。

（10）、用分光光度计在540nm的波长的光下以空白管为对照测定A,B管的反应液的吸光度，并计算出酶活。

（11）、选出发酵产酶的最佳pH。

9、正交试验（本次实验的正交试验采用3因素3水平来进行试验）：
（1）、因素的选择与水平的选择（本次使用我们组选择碳源浓度、氮源浓度和接种量这3个因素来做正交试验）：根据以上的碳源浓度、氮源浓度和接种量的条件优化的三个实验来选出最佳的发酵产酶水平并以该水平为中间值来各设定三个水平（如下表）：
A（碳源浓度）B（氮源浓度）C（接种量）
因素
水平
水平1 1（1%）1（1%）1（4%）
水平2 2（2%）2（1.5%）2（5%）
水平3 3（3%）3（2%）3（6%）
（2）、根据正交表中各个因素对应的水平并结合三因素三水平表中各个因素的水平的量来配制培养基并接种；
序号 A B C
1 1 1 1
2 1 2 2
3 1 3 3
4 2 1 2
5 2 2 3
6 2 3 1
7 3 1 3
8 3 2 1
9 3 3 2
（3）、将接种好的培养基置于30℃的恒温培养箱中培养48h。

（4）、发酵完成后取出一部分烘干。

（5）、以DNS法测定酶活。

（6）、进行数据分析并选出最佳的条件组合。

五、实验报告
（一）、实验现象、数据和结果及分析讨论；
1、菌种的选择的数据及结果（稀释1倍）：
菌种OD A OD B酶活K1 0.323 0.297 0.419 K2 0.236 0.108 0.264 K3 0.171 0.166 0.258 K4 0.214 0.183 0.290 K5 0.195 0.192 0.288
菌种
k5
k4
k3
k2
k1
.5
.4
.3
.2
分析：该次发酵产酶所得的酶活很低，可能原因：我们所筛选的是霉菌而我们采用液体发酵，从而导致产酶量不高。

结果：从表中可知k1菌种产酶较好故而采用K1作为以后实验的菌种。

2、氮源的选择的数据及结果（稀释20倍）：
氮源OD A OD B酶活
牛肉膏0.062 0.057 3.487
蛋白胨0.082 0.078 3.195
硫酸铵0.038 0.046 2.623
DY
硫酸铵
蛋白胨
牛肉膏
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
2.4
结果：该试验中得到最适的氮源是蛋白胨。

3、氮源浓度选择的数据及结果（稀释20倍）： 氮源 OD A OD B 酶活
0.5% 0.065 0.064 2.859 1.0% 0.057 0.052 2.646 1.5% 0.191 0.219 6.022 2.0% 0.103 0.204 4.867 2.5% 0.090 0.100
3.554
1234
5670.50% 1.00% 1.50%
2.00% 2.50%
氮源浓度选择
2.859
2.646
6.022
4.867
3.554
氮源浓度
酶活
系列2
结果：发酵产酶的最适氮源浓度为1.5%。

4、碳源的选择的数据及结果（稀释20倍）：
碳源OD A OD B酶活果胶0.090 0.094 3.487 橘子粉0.078 0.080 3.195 葡萄糖0.048 0.059 2.623
碳源
葡萄糖
橘子粉
果胶
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
2.4
结果：最适的发酵产酶的碳源为果胶。

5、碳源浓度的选择的数据及结果（稀释20倍）：
碳源浓度OD A OD B酶活0% 0.112 0.137 4.182
0.5% 0.127 0.143 4.452
1.0% 0.192 0.200 5.820
2.0% 0.283 0.259 7.502
3.0% 0.026 0.057 2.354
12345
678
0%0.50% 1.00% 2.00% 3.00%
碳源浓度的选择
4.182
4.452
5.82
7.502
2.354
碳源浓度
酶活
系列2
结果：最适发酵产酶的碳源浓度是2.0%。

6、接种量的选择的数据及结果（稀释20倍）：
接种量 OD A OD B 酶活 4% 0.092 0.092 3.487 5% 0.228 0.200 6.224 6% 0.053 0.045 2.522 7% 0.007 0.011 1.625 8% 0.000 0.010 1.535
12345
674%5%
6%7%8%
接种量的选择
3.487
6.224
2.522
1.625
1.535
接种量
酶活
系列2
结果：最适接种量为5%。

7、含水量的选择数据及结果（稀释20倍）： 含水量 OD A OD B 酶活
50% 0.099 0.079 3.420 55% 0.136 0.144 4.564 60% 0.092 0.112 3.711 65% 0.093 0.055 3.083 70% 0.025 0.020
1.928
结果：发酵产酶的最适含水量为55%。

8、pH的优化实验数据及结果（稀释1倍）：
pH OD A OD B酶活3.0 0.107 0.114 0.195
3.5 0.083 0.082 0.164
4.0 0.175 0.184 0.272
4.5 0.332 0.291 0.421
5.0 0.250 0.241 0.347
5.5 0.122 0.124 0.209
6.0 0.087 0.042 0.144
0.05
0.10.150.20.250.30.350.40.453
3.5
4
4.55
5.56
pH 的优化实验
0.195
0.164
0.272
0.421
0.347
0.2090.144
ph
酶活
系列2
分析：该试验中酶活普遍较低。

可能原因：采用液体发酵。

酶活变化不规律。

可能原因：在加入酶液的时候把酶液或碱液加在试管壁上以造成酶量不够或反应的环境中偏酸而造成DNS 不能正常显色。

结果：该种霉菌的最适发酵产酶的pH 为4.5。

9、发酵时间的优化的数据及结果（稀释20倍）： 发酵时间 OD A OD B 酶活 36h 0.197 0.183 5.685 48h 0.225 0.231 6.538 60h 0.200 0.201 5.921 72h 0.182 0.198 5.685 84h 0.158 0.181 5.225
1234
5
6736h
48h
60h 72h
84h
发酵时间的优化
5.685
6.538
5.921
5.685
5.225
发酵时间
酶活系列1
结果：该种霉菌的发酵产酶的最适时间为48小时。

10、正交试验的数据及结果（稀释20倍）： 序号 OD A OD B 酶活 1 0.099 0.079 3.420 2 0.103 0.121 3.936 3 0.091 0.094 3.498 4 0.099 0.097 3.622 5 0.101 0.107 3.756 6 0.089 0.084 3.363 7 0.132 0.124 4.294 8 0.097 0.095 3.577 9 0.102 0.112 3.823
1. 碳源浓度
Dependent Variable: 酶活3.618.152 2.964 4.2723.580.152 2.927 4.2343.898
.152
3.244
4.552
碳源浓度1%2%3%
Mean Std. Error
Lower Bound Upper Bound
95% Confidence Interval
2. 氮源浓度
Dependent Variable: 酶活3.779.152 3.125 4.4323.756.152 3.103 4.4103.561
.152
2.908 4.215
氮源浓度
1%1.5%2%
Mean Std. Error
Lower Bound Upper Bound
95% Confidence Interval
3. 接种量
Dependent Variable: 酶活3.453.152 2.800 4.1073.794.152 3.140 4.4473.849
.152
3.196
4.503
接种量
4%5%6%
Mean Std. Error
Lower Bound Upper Bound
95% Confidence Interval
Tests of Between-Subjects Effects
Dependent Variable: 酶活.542a 6.090 1.305.495123.1291123.1291777.523.001.1812.090 1.305.434.0862.043.619.618.2762.138 1.990
.334
.1392.069
123.8099.681
8
Source
Corrected Model Intercept TYND DYND JZL Error Total
Corrected Total
Type III Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.R Squared = .796 (Adjusted R Squared = .186)
a.
分析：该次实验的酶活相较与其他几个实验酶活降低。

可能原因：（1）、菌种摆放时间太长导致菌种老化；（2）、由于该试验进行过程中在发酵物的烘干时由于烘箱温度降低而导致发酵时间过长。

从而使酶活降低。

（3）、由于没有柠檬酸所以无法配制缓冲液，用水来稀释酶液并用水配制地物从而导致反应环境的pH不合适，从而影响酶活的测定。

结果：得到的最佳组合为：3、1、3即碳源浓度3%，氮源浓度1%，接种量6%。

与上方多个试验所得的结果不同，可能是因为三个因素相互影响（形成不同的碳氮比）而导致与上方实验的结果不同。

上方结果中碳氮比为3：1时产酶最佳，所以在该霉菌发酵产酶时碳氮比为3：1时产酶效果较好。

（二）、实验结论：从上方的各个试验中可知，筛选出的霉菌产酶的最适氮源为蛋白胨，浓度为1.5%，最适碳源为果胶，浓度为2.0%，最适接种量5%、最适含水量55%，最适pH4.5。

碳氮比3：1。

（三）、实验总结：
1、本次试验的成败之处及其原因分析
（1）、由于不能长时间在实验室，不能经常对整个发酵过程进行检查，可能会因为仪器的问题（如培养箱）而使实验结果不太接近实际。

（2）、由于到后期材料和试剂不够，导致底物与酶的稀释是使用水来进行，这样就使得测出的酶活偏低。

（3）、由于操作不熟练，导致加酶液或碱液的时候加到管壁上，导致酶或碱液的损失从而使测定结果不符合实际值。

（4）、由于是霉菌，使用固体发酵培养基来发酵，PH无法控制，从而导致条件优化不是很接近实际，而使用液体发酵酶活太低，不易测定。

（5）、优化的条件不是很完整。

若要重做该实验
（1）、应该尽量筛选细菌，以便于液体培养从而便于调节PH值。

（2）、测定酶活时尽量用稍小一些的试管，加入其他物质时尽量接近液面，以防止酶液的损失。

（3）、测定酶活时要使反应环境的PH在3.0左右，使得测定的酶活较接近真实值。

（4）、尽量多查看培养箱及烘箱的温度，以免温度的变换而影响酶活。

（5）、还可以增加一些优化条件的梯度。

2、本次试验的关键处
（1）、该实验在菌种的筛选时十分重要，在撒土样时必须注意不要撒的太多或太密，以免在菌落生长时长得过密从而影响分离纯化。

在分离培养基中分离菌种时要注意不要太用力去画线，以免刮破平板从而影响透明圈的观察。

（2）、在测定酶活时要注意所加的酶液或碱液时不要将其加在试管内壁上，以免造成酶或碱液的损失而造成测定结果不准确。

（3）酶活测定时的反应环境的pH十分重要若PH不合适则会影响到酶活的测定，故而要使用pH=3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液来制取酶液及配置底物。

3、自我评价
（1）、本次试验从菌种的筛选到产酶条件的优化整个过程都完全由同学自己独立完成，从而提高我们的动手能力与组织能力及合作能力。