昆虫病原真菌致病寄主的机制和基因工程改良

随着大量使用化学合成农药所造成的环境污染 和害虫抗药性提高等问题日益突出，生物防治越来 越受到重视 。昆虫病原真菌是自然界中昆虫种群
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并有了商业产品 m.n。 4;5=H86549 ）等 )( 余种应用较广， 虽然昆虫病原真菌得到了广泛的应用，但仍存在击 倒时间长和防效易受环境影响等缺点。为充分挖掘 昆虫病原真菌的应用潜力，必须阐明它们致病昆虫 的分子机制m+n。近年来， 昆虫病原真菌特别是金龟子 绿僵菌致病机理方面的研究有了长足的进展。利用 基因工程等手段对昆虫病原真菌进行改造，获得安 全、 高效的真菌杀虫菌剂， 已成为可能。本文将着重 介绍近年来有关昆虫病原真菌致病分子机理和基因 工程改良的重要进展和前景。
。 胞 内 第 二 信 使 2%!3 和 环 腺 苷 酸（4567 ）参 与
附着胞形成。这些信号转换路径的一些成分已经从 金龟子绿僵菌中鉴定出来 。 89:;(<(’ 等 提出，附
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着胞的 形 成 与 2% 浓 度 梯 度 被 破 坏 从 而 激 活 一 种
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离子通道相关。 当附着胞开始形成时， 4567 水平会 大 幅 度 地 上 升 。 一 种 依 赖 4567 的 蛋 白 质 激 酶
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农 业 生 物 技 术 学 报
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昆虫体壁可以分为外表皮、 前表皮、 后表皮和皮脂层 主要由蜡质层和鞣化的蛋白质组 $ 层。外表皮很薄， 成。前表皮和后表皮主要有几丁质骨架和填充在其 间的蛋白质组成的坚固的昆虫骨骼。昆虫病原真菌 则通过产生水解酶和机械压力来穿透寄主的体壁。 昆虫病原真菌从分生孢子萌发开始侵染到菌体 重新在虫体上产生孢子的过程，可分为如下几个步 骤： 孢子粘附在昆虫体壁上； 孢子萌发并产生侵染结 构； 菌丝穿透昆虫体壁； 菌体在昆虫的血腔中生长； 导致昆虫死亡； 菌丝在虫体上长出并形成孢子。 相对 而言，金龟子绿僵菌穿透昆虫体壁这一步研究得较 为详细。 昆虫病原真菌的致病机制， 尤其在侵染结构 形成、入侵宿主和毒素介导宿主死亡等方面与一些 植物致病真菌相似。了解这些过程将为选择和改良 菌株提供理论依据。 附着胞的形成 !" !#### 和许多植物致病真菌一样，昆虫病原真菌的分 生孢子在宿主的体表经常分化出附着胞（ %&&’())*+
数量得以控制的主要因素之一 。与其它生防微生
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物相比， 昆虫病原真菌具有主动侵染、 寄主不易产生 抗性和可观的扩散效果等特点， 因此， 昆虫病原真菌 作为一种潜力巨大的生物防治工具而倍受关注。目 前，用于害虫生物防治的昆虫病原真菌涉及半知菌 亚 门 （o9?L9IH3:BHL54; ） 和 接 合 菌 亚 门 （_:KH3:BHL5;4 ） 的 数 百 个 种 ， 其 中 球 孢 白 僵 菌 （M94?Z9I54 [4==54;4 ） 、 金 龟 子 绿 僵 菌（T9L4IN5j5?3
农业生物技术学报
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昆虫病原真菌致病寄主的机制和基因工程改良 R
裴 炎 方卫国 张永军
（西南农业大学生物技术研究中心， 重庆 +((S)$ ）
摘要： 随着大量施用化学农药所造成的环境污染等问题日益突出， 真菌杀虫剂的研究和开发受到了广泛的关注。由于存 在击倒昆虫时间较长、 对环境条件要求高等缺点， 昆虫病原真菌的广泛应用受到限制。因此， 有必要弄清昆虫病原真菌致病寄 主过程的遗传学和分子生物学机理， 找出控制毒力的主效基因。在此基础上， 利用基因工程和细胞工程等技术提高菌株毒力， 创造出更适合市场需要的真菌杀虫剂。文章重点介绍了近年来有关昆虫病原真菌致病机理的研究进展， 包括侵染寄主过程中 附着胞的形成、 降解昆虫体壁的Hale Waihona Puke Baidu子机理和昆虫病原真菌的毒素等。同时， 还介绍了昆虫病原真菌的遗传转化方法和基因工程 改良的一些新进展。 关键词： 昆虫病原真菌； 致病机理； 菌株改良； 基因工程
T9BN4;5=3AHJAU?;K46AV4LNHK9;9=5=A5;AW;=9BLA4;XA YLI45;AW38IHZ939;LA[:A\9;9A1;K5;99I5;K
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’,-.）。附着胞的功能就是提供机械压力和分解的
体壁降解酶帮助侵染钉穿透昆虫体壁。在金龟子绿 僵菌、 球孢白僵菌等大多昆虫病原真菌中， 附着胞的 产生对于建立病原与宿主之间的关系是至关重要的
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。同时研究表明， 7’H 的表达受碳氮抑
制。 在克隆的 7’H% 基因的启动子上有碳调控因子结 合位点（0NO><P4@Q<<R<S#N ）和氮调控因子结合位点 ， 而且碳调控蛋白 （相隔很近的 TJ5 序列 G5U5 ） 基因 2’’H/H01和氮调控蛋白基因 D’’H 都已克隆 /H=1。 在金龟子绿僵菌 7’H 类蛋白酶至少有 $ 种同工 酶/H$1， 连同已发表的 7’H%/HC1和 7’HV 基因 /HB1， 从金龟子 绿僵菌 6WH 菌株 （即 5R8WXY!0C0 菌株） 克隆的 在 7’H 同 工 酶 基 因 还 有 7’HG、 7’H? 和 7’HZ 等 ， G(DL%D[ 登 录 号 分 别 为 5\!0HF=$ 、 5\!F#!!" 和 5\$H==BF 。对这些 7’H 类基因的氨基酸序列进行分 析发现， 它们的活性区域都一样， 其它部分序列变化 较大。 证明 7’H 类蛋白酶在昆虫病原真菌致病寄主过 程中起重要的直接证据是对 7’H% 基因的破坏和超 量表达实验。7’H% 基因被破坏的金龟子绿僵菌毒力 有下降现象， 由于在这个突变体中同时有 7’H% 的同 工酶 7’HV 等和一个金属蛋白酶高水平表达， 使得毒 力下降不明显/HF1。 但是， 7’H% 高效表达的金龟子绿僵 菌菌株的毒力明显提高，杀虫时间缩短了 !0] ， 作 物损失减少了 $"] 。 同时证明 7’H% 基因是一个致病 因子， 在昆虫血淋巴中高浓度的 7’H% 蛋白酶会引起 昆虫酚氧化酶的过度表达， 导致昆虫中毒死亡/!"1。 同 时由于在血腔中高水平表达的 7’H 降解了寄主的免 疫蛋白和脱毒蛋白， 降低了寄主的免疫能力， 从而使 击倒昆虫的时间缩短/!H1。这就使得人们想将 7’H% 用
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附着胞的形成可能还有其它的一些可能的信号 传导途径， 例如， 昆虫病原真菌与植物和动物的病原 真菌一样都可能存在促分裂原活化蛋白激酶 （657? ） 途径 。另外， 在植物病原真菌中， 疏水蛋
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白对附着胞的形成也有较大影响， 67GH 被破坏的 稻瘟病菌菌株的附着胞形成的效率和毒力都降低
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>7?5@: 的调节亚基已经从金龟子绿僵菌中鉴定出
来， 添加 7?5 抑制剂 AB 会选择性地抑制附着胞的 形成
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。离体条件下 4567 在附着胞发育中的作用
同样在稻瘟病菌 6%<D%&*’9E( <’,)(% 中被证实。 已经 从 6%<D%&*’9E( <’,)(% 中克隆出了 7?5 基因。破坏 这一基因会特异性地阻止附着胞的形成，但对菌丝 生长、 产孢和有性生殖没有影响 。
。在金龟子绿僵菌中克隆了有疏水蛋白的 ))<% 基
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因， 但是它的功能有待进一步研究 。
第 !" 期
裴
炎等 # 昆虫病原真菌致病寄主的机制和基因工程改良
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于植物抗虫育种和将 $%&’ 基因导入昆虫病毒中以 提高其杀虫速度 。
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多大， 还有待进一步研究。 毒素的作用 !" $%%%% 昆虫病原真菌在寄主血腔内主要以原生质体、 类似原生质体和囊胞子等形式存在，这种生长形式 的转换也出现在人类病原真菌 （如白色假丝酵母） 和植物病原真菌 （如尖孢镰刀菌） 中， 它一方面有助 于在体血腔中的分散与群集，通过增加表面积获取 更多的营养物质，另一方面由于这类细胞表面的细 胞壁多糖很少，可最大限度不激发寄主的免疫反应
分解寄主外壳的水解酶 !" $#### 昆虫病原真菌通过机械压力和水解酶的水解作 用穿透昆虫体壁。 相对昆虫体壁的组成成分， 病原真 菌产生的水解酶有几丁质酶、蛋白酶和脂酶等。目 前， 对脂酶的作用了解不多， 蛋白酶的作用研究得较 为清楚， 几丁质酶次之/H!1。
!" $" ! :::: 蛋白 质 降 解 酶
"# OOO昆虫病原真菌侵染的分子机理
! 基金项目 !" 国家高技术研究与发展计划（#$% ）项目（&’()**&)+’,- ）和国家自然科学基金项目（.’’/’’’- ）。
裴 炎 ! 男， 博导， 教授。 123456!7895:4;<=>4?@ABC@AB;D@ -0+/ 年生，
AAA 收稿日期： &((&E)(F))AAAA 接受日期 !&((&F)&F&)
在附着胞和以昆虫体壁为
唯一碳氮源的诱导培养基中有多种蛋白酶的表达， 这些蛋白酶可分为两大类。其一是对底物短肽 包 括 7’H（ 类 枯 8-4+5I%+5I%+7’*+7E(+JK 具 有 活 性 ， 草 杆 菌 蛋 白 酶 ） ； 另 一 类 是 对 短 肽 包括 7’! （胰 L(D+7E(+M%I+5’<+J5 有活性的蛋白酶， /H#1 蛋白酶） 。 2*I( 等 报道的 7’$ 后来被证明是 7’! 的 同工酶。 用组织免疫定位法证明， 7’H 类 蛋 白 酶 是 在 附 着胞和穿透寄主体壁的早期就有高水平表达， 7’H 在侵染 !:E 后大量产生， 与昆虫体壁接触后， 在 !$:E 内 7’H 的表达提高 H" 倍左右， =":E 后由菌丝附近向 周围扩散