酶抑制剂筛选模型研究进展

酶抑制剂筛选模型研究进展
通过查阅文献，综述目前酶抑制剂筛选的主要模型，包括动物模型、高通量筛选模型及固定化酶反应器。

并对其应用原理、应用情况及优缺点进行了阐述。

标签：酶抑制剂；筛选模型；靶点；验证
20世纪60年代，日本科学家梅译滨夫提出了酶抑制剂的概念，从而将抗生素的研究扩大到酶抑制剂的新领域。

随着酶学研究的深入，对酶结构的认识，已能在分子水平上认识酶的作用机制，并根据酶的作用原理来设计各种酶的专一抑制剂作为药物，来调节体内的异常代谢。

酶抑制剂作为药物的治疗基础是通过限制酶催化底物的反应能力，使底物浓度增高或代谢产物浓度降低，以达到改善症状的目的。

在一系列酶促反应中，以抑制限速酶或关键酶的效果最好。

在目前上市的药物中，以受体为靶点的药物占52%，以酶为靶点的药物占22%，以离子通道为靶点的药物占6%，以核酸为靶点的药物占3%。

酶抑制剂的开发是新药的重要来源。

随着现代生物科学技术的发展，酶抑制剂作为药物越来越受到医药界的重视。

药物筛选模型是用于证明某种物质具有药理活性（生物活性、治疗作用）的实验方法，是寻找和发现药物的重要途径之一。

在长期寻找药物的实践过程中，建立了大量用于新药筛选的各类模型，在新药发现和研究中发挥了积极的作用。

随着生命科学的发展，新的药物筛选模型不断出现，不仅促进了药物的发现，而且对药物筛选的方法、理论、技术都产生了巨大影响[1]。

酶抑制剂的筛选模型主要为动物模型和细胞分子水平筛选模型。

动物模型由于规模小、效率低、样品量大、成本高等缺点，不适合作为药物初筛的模型。

细胞和分子水平的筛选模型，具有材料用量少、药物作用机制比较明确、可实现大规模筛选和一药多筛等特点[1]，已成为目前酶抑制剂筛选的主要方法。

本文就近几年来酶抑制筛选的主要模型进行综述。

1 高通量筛选模型
高通量筛选是以分子细胞水平的实验方法为基础，以微型板为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理，同时对数以万计的样品进行检测。

高通量筛选以其高效、快速的优点，已成为酶抑制剂新药发现的主要手段。

酶抑制剂的高通量筛选模型，主要为分子水平的筛选模型，也有少量细胞水平的筛选模型。

筛选以酶为作用靶点的药物，不仅要观察酶与药物的结合，更要观察药物对酶活性的影响。

根据酶的特点，酶的反应底物和产物都可作为检测指标[2]。

以酶为作用靶点的高通量检测方法，绝大多数是直接检测酶的活性，主要有基于放射性的方法和基于比色、荧光的方法两大类[3]。

曹鸿鹏等[4]采用荧光分析法建立了流感病毒神经氨酸酶抑制剂的高通量筛选模型，从甲型及乙型流感病毒中制备出神经氨酸酶，以有荧光特性的化合物为酶的底物，利用96孔板建立了适合高通量筛选神经氨酸酶抑制剂的荧光分析法。

方法：96孔板中，100 μl体系中含有20 μmol/L MUNANA（底物），3 μl神经氨酸酶溶液，10 μl待测样品溶液，37℃，pH 3.5，孵育15 min，355/460 nm测定荧光强度。

张冉等[5]采用比色法建立了α-葡萄糖苷酶抑制剂的高通量筛选模型。

从小肠上段提取α-葡萄糖苷酶，以蔗糖为底物，通过测定体系中葡萄糖的生成量来检测α-葡萄糖苷酶的活性。

方法：384孔微板中，20 μl体系中含有10 μl酶提取液，30 mmol/L的蔗糖5 μL，待测样品5 μl，37℃，孵育30 min，505 nm波长下测定吸光度。

李婷等[6]也建立了α-葡萄糖苷酶抑制剂的高通量筛选模型。

方法：96孔板中，160 μl体系含2.5 mmol/L和0.2 U/ml α-葡萄糖苷酶，37℃，pH 7.0，反应15 min，400 nm波长处测定吸光度。

V ollmer等[7]采用放射法建立了一种以青霉素结合蛋白（PBP）为靶的抗生素的高通量筛选方法。

PBP既是糖基转移酶又是肽转移酶，该法是筛选其糖基转移结构域的活性位点上的可结合物。

方法：96孔板中加入莫诺霉素混悬液，然后加入3H标记的PBP（细菌膜粗提物）和受试化合物，孵育，过滤去掉非结合的放射性，闪烁计数测得放射性指示PBP与莫诺霉素结合的情况及受试化合物对其的影响。

另外，根据酶的特点，还有一些特殊的方法。

肖尚志[8]建立了醛糖还原酶抑制剂的高通量筛选模型。

组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞至8～15代时，用胰蛋白酶消化后，接种至24孔板，加入胎牛血清浓度为10%、葡萄糖浓度为37.5 mmol/L的培养液，含药血清20 μl，孵育48 h后，收集细胞，离心取上清液，与辅酶NADPH加上足量的底物在一定缓冲体系中反应。

由于NADPH 为自身含有荧光的物质，故反应后，高效液相色谱367/455 nm波长下检测荧光强度便可反映NADPH的消耗情况，从而推算出醛糖还原酶的活性。

Hammonds 等建立了真核生物拓扑异构酶Ⅱ抑制剂的高通量筛选方法。

啤酒酵母菌株经改造后使表达人拓扑异构酶Ⅱα或Ⅱβ。

将细胞与受试药物在96孔板上孵育后，在630 nm波长处测其吸收度值，从而检测药物对细胞生长情况及酶活性的影响。

高通量筛选模型已成功应用于p56lck激酶、DNA拓扑异构酶、醛糖还原酶、神经氨酸酶、环氧化物水解酶[9]、转谷氨酰胺酶等抑制剂的筛选。

2 固定化酶反应器（IMER）
固定化酶是通过物理和化学的方法，将酶固定于特定的载体上制成仍具有催化活性的酶的衍生物。

固定化酶不需要高纯度的酶，降低了对酶的需求，对热、有机溶剂和pH的稳定性增加；可以反复长期使用，只需要简单的清洗过程，就可以恢复活性。

与溶液中的蛋白质酶解反应相比，固定化的酶具有更高的酶/底物比、更高的酶解效率、更高的稳定性，并能减少酶的自身降解，因此在酶抑制剂的筛选中得到越来越广泛的应用。

主要缺点是固定化酶对底物的亲和力略有降
低，可能是由于：①酶固定化后，活性中心的氨基酸残基、空间结构和电荷状态发生了变化；②在固定化酶的周围，形成了能对底物产生立体影响的扩散层及静电的相互作用。

IMER以阳性药来评价模型的有效性。

2.1 α-葡萄糖苷酶抑制剂的固定化酶筛选模型
卢大胜等[10]建立了α-葡萄糖苷酶抑制剂的固定化酶筛选模型。

以高脱乙酰度壳聚糖为载体，以三羟甲基磷（THP）为交联剂，将α-葡萄糖苷酶的N端固定，装柱，模拟其在体内小肠壁上的情况。

方法：直径0.5 cm、长5.5 cm的层析柱中，加入50 μl PNPG（0.116 mol/L），待测样品，37℃水浴中反应10 min，用紫外分光光度计在400 nm波长处测定吸收度值。

与游离酶相比较，固定化酶筛选模型上的酶由于N端被固定，其空间结构有所制约，从而使与底物的结合受到一定程度的限制，导致其在实验中的活力偏低，但这正是它模拟酶在小肠壁上的情况，所以实验中反映出来的数据更接近于体内。

该固定化酶筛选模型可重复使用，适合高效、便利、快速的筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂，还可直接在体外评价α-葡萄糖苷酶抑制剂的作用效果，研究一些已知能够治疗糖尿病的天然产物的作用机制。

2.2 IMER-HPLC
将酶固定到色谱填料上，用装柱的方式制成IMER，与高效液相系统及质谱系统联用，可以进行酶抑制剂混合物的快速筛选。

该法将色谱系统的选择性、快速、无破坏性及重现性与IMER的特异性和灵敏性相结合，可以极大的增强检测的灵敏度，且可用于痕量化合物的检测，因此在药物筛选中具有广阔的前景。

Bartolini等[11]采用IMER-HPLC方法建立了人重组体乙酰胆碱酯酶（hrAChE）抑制剂的筛选模型。

采用戊二醛为交联剂，将hrAChE固定于12 mm×3 mm i.d的CIM整体柱：CIM柱经缓冲溶液平衡后，放入10%的戊二醛缓冲液中暗处搅拌6 h后，加入hrAChE稀释（1.74 U/100 μl）反应过夜。

加入10 ml，0.1 mol/L的氰基硼氢酸溶液，25℃反应2 h后用缓冲溶液冲洗。

将CIM柱装于合适支持物中即可用于高效液相色谱法，紫外检测器450 nm波长处测吸收度。

方法：一定浓度的底物单独进样，其峰面积为A0，含一定浓度底物的抑制剂进样，其峰面积记为Ai，则酶的百分抑制率为100-（Ai/A0×100）。

该模型的建立减少了酶的用量，极大地提高了分析速度，实现了酶抑制剂的快速筛选，以及混合物的筛选。

2.3 IMER-HPLC-MS/MS
IMER色谱串联质谱，可以直接获得酶的活性信息、碎片信息、结构信息及亲和信息，实现了酶抑制剂的高通量筛选。

Hodgson等[12]建立了腺苷脱氨酶的IMER色谱串联质谱法。

采用溶胶-凝胶技术将腺苷脱氨酶固定于毛细管整体柱：DGS加水制成凝胶，加入适当pH的腺苷脱氨酶溶液中，迅速加入40 μl多聚腺苷水溶液，充分混合后转入长80 cm，内径250 μm，外径360 μm的聚酰亚胺涂渍的熔融硅管中。

封口，pH 6.5，陈化
5 d。

将整体柱切为10 cm长度作为色谱柱用于高效液相串联质谱进行抑制剂筛选。

采用两元泵液相色谱，A泵以底物为流动相，B泵以底物、待筛样品混合物为流动相，总流速保持不变，通过梯度改变两泵的流速比来调整待筛样品的浓度。

通过多反应监测模式在线质谱检测，可分别获得产物、底物浓度，根据产物的减少和底物的增加来评价被筛样品对酶活性的影响，通过定量分析还可获得抑制剂的IC50值、K1值和Km值。

IMER色谱串联，降低了筛选成本，减少了分析时间，无需色谱分离过程，实现了酶抑制剂的快速筛选以及酶抑制剂混合物的筛选[13]。

IMER已成功应用于多巴胺β-羟化酶、α-葡萄糖苷酶、β-分泌酶、腺苷脱氨酶、苯乙醇胺N-甲基转移酶等抑制剂的筛选。

3 动物模型
动物模型是以动物为药物筛选的对象，以动物对药物的反应，证明某些物质的药理作用，评价其药用价值。

药物筛选中应用的动物模型通常是动物的病理模型。

理想的动物模型应具备的基本条件：病理机制与人类疾病的相似性、病理表现的稳定性和药物作用的可观察性[14]。

由于很多因素会影响与酶靶点作用的化合物的药理作用，在体外对靶分子或细胞作用较强的物质，在体内可能会被迅速降解或经过旁路途径功能的调整而降低或消除活性成分的作用，许多在体外作用强度较高的酶抑制剂活性成分在生物体内可能显示不出理想的作用效果，因此必须通过动物模型进行复筛[15]。

醛糖还原酶抑制剂筛选的动物模型主要有四氧嘧啶诱导模型和链脲佐菌素诱导模型[16]。

动物给药后，提取分离血浆中的红细胞，采用分光光度法、柱层析法、荧光法和ELISA等方法测定红细胞中醛糖还原酶的活性。

神经氨酸酶抑制剂筛选通常采用感染了致死性流感病毒的小鼠或雪貂为对象[17]，通过观察不同给药时间药物对致死性、体重减轻及动脉氧饱和度降低的保护作用，评价药物的作用。

4 筛选模型的验证
建立药物筛选模型的目的是为了筛选活性化合物，反应化合物所具有的生物活性，因此，对筛选模型能否准确的反应化合物的生物活性，必须进行验证[18]。

4.1 可行性验证
以阳性抑制剂为对照，考察筛选模型对阳性抑制剂的识别能力。

一般将该筛选模型获得的阳性抑制剂的IC50与文献报道相比较，结果一致，该筛选模型才具有实用性[13]。

4.2 灵敏性验证
一般以信号本底比、信噪比和Z′因子来进行评价。

信号本底比>3，信噪比>10，Z′因子>0.4，模型才能灵敏的反应样品的活性。

对于高通量筛选，Z′因子>10才能满足要求[19]。

4.3 稳定性验证
考察Z′因子的日内、日间精密度或阳性抑制剂抑制率的日内、日间精密度，以保证筛选结果稳定，在重复试验中能获得一致的结果[19]。

5 展望
药物筛选是寻找新药的重要途径，建立相应的药物筛选模型是药物筛选的关键环节。

高通量筛选模型的出现实现了酶抑制的快速筛选及一药多筛，极大地促进了酶抑制剂筛选的发展。

IMER与色谱系统联用，实现了混合物的快速筛选，使酶抑制剂的筛选又上新的台阶。

近年来，随着计算机技术和生物信息学的快速发展，应用计算机虚拟配体技术进行体外药物筛选已经成为一种与高通量筛选互补的实用化工具，筛选过程无需消耗样品和其他实验材料，既省时又经济。

另外生物芯片技术的应用，能够在微小的芯片上获得大量的生物活性数据，在药物筛选中显示出巨大的优势。

相信随着科学技术的发展，将会有更多的筛选模型用于筛选，极大地缩短新药发现周期。

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