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宏基因组文库的分析
宏基因组文 库
Metagenomic Library
通过PCR 或者杂 交筛选特定序列
SIGEX
通过功能筛选特 定表型的阳性克
隆
基于宏基因组分离筛选功能基因 的四个技术要素
载体 Vector
环境样品DNA制备 DNA Preparation
自然产品筛选平台
Natural Product Discovery Platform
Metagenomic library
sequence
Screen for specific sequences by PCR or hybridisation
SIGEX
Functional screening for expression of particular phenotype
细菌16S rRNA的测序分析
Environmental sample
Extract metagenomic DNA
Construct 16S (18S) rRNA gene library using PCR
Clone into vector
eg plasmid, cosmid
phosmid, BAC
Introduce into host eg E. coli
ITS 1 和ITS 2 是中度保守区域, 其保守性基本上表现为种内相对一 致,种间差异比较明显。IT S 的序列分析能实质性地反映出属间、 种 间以及菌株间的碱基对差异,此外ITS 序列片段较小、 易于分析, 目 前已被广泛应用于这种特点使ITS 适合于真菌物种的分子鉴定以及属 内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。
高通量筛选 High Throughput
Screening
Baidu Nhomakorabea
宿主Host
环境样品DNA制备
原位裂解法：将土壤样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理, 继而抽提纯 化。 此法操作容易、成本低、DNA提取率高、偏差小, 但由于强烈的 机械剪切作用, 所提取的DNA片段较小(1-50 kb)，且腐殖酸类物质也 难以完全去除。
载体
一般选用质粒、粘粒或者Fosmid 载体来构建文库，其插入片 断小于40kb, 对生物合成比较复杂的化合物，因其基因簇较大 ，则无法完整克隆。
细菌人工染色体（BAC）载体能克隆100 kb以上的大插入片断 ，完全有可能克隆到完整的代谢基因簇途径，但是其拷贝数目 和表达量低。因而可选择和改进已有的穿梭 BAC 载体来构建 文库，达到其拷贝数量可以诱导控制的目的，在必要时可诱导 增加载体拷贝数以获得大量DNA进行亚克隆和序列分析。
通过设计特异的PCR引物，扩增得到ITS序列，然后两端加上接头，便可利 用Illumilla的高通量测序技术对ITS进行测序分析，以获得环境样品中真菌 等的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。
宏基因组文库
环境样品
宏基因组文库的构建 抽提DNA 克隆(多种载体) 转化适宜宿主细菌(如大肠杆菌)
Chakravorty 等（2019）总结16S rDNA 的序列，及其中 九个9个可变区和10个保守区的位置和长度，并指出不同的 可变区适合不同菌群的鉴定分析。其中V3（约60 bp）和V6 区（约70 bp）可以分别用来鉴定大多数细菌。
16S rDNA
通过设计特异的PCR引物，扩增得到V3或V6区的序列，然 后两端加上接头，便可利用Illumilla的高通量测序技术对V3或 V6区进行测序分析，以获得环境样品中细菌等物种分类、物 种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。
16S rDNA指的是细菌基因组中编码核糖体16S rRNA 分子的对 应的DNA序列，也就是16S rRNA 的编码基因。其长度大约为 1500 bp
通过16S rDNA的测序，可以分析环境的群落构成，以及进行细 菌的分类和进化分析。
细菌16S rRNA的V3或V6区的测序分析
Ashelford 等（2019）通过对4383个细菌16S rDNA的序列 进行比对分析，表明16S rDNA 全长序列中包含9个可变区 （V1-V9）和10个保守区。其中保守区反映生物物种间的亲 缘关系，可变区则表明物种间的差异。
异位裂解法：采用物理方法将微生物细胞从土壤中分离出来, 然后采 用较温和的方法抽提DNA, 如先采用尼可登介质密度梯度离心分离微 生物细胞, 然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解, 脉冲场凝胶电泳回收 DNA。 可获得大片段DNA (20～500 kb) 且纯度高, 但操作繁琐, 成本高, 有 些微生物在分离过程中可能丢失, 温和条件下一些细胞壁较厚的微生 物DNA难以抽提出来。
真菌ITS的高通量测序分析
ITS(Internal Transcribed Spacers )，即核糖体内转录间隔 区 ，是位于 28S rDNA的3’端与 18S rDNA的 5’端之间的序列 ITS常用于真菌的分类研究，其长度一般为650-750 bp ITS包含ITS1和ITS2两个区域。其中ITS1 位于 18S rDNA和 5.8S rDNA之间，ITS2位于 5.8S rDNA和 28S rDNA之间
Metagenome VS Genome
目录
宏基因组简介 宏基因组的常用研究方法
16S (18S) rDNA测序
宏基因组文库
—功能基因筛选（策略一）
宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
Metagenomics involves constructing DNA libraries from environmental DNA
宏基因组功能基因的筛选
WCX 2019年3月17日
目录
宏基因组简介 宏基因组的常用研究方法
16S (18S) rDNA测序 宏基因组文库
—功能基因筛选（策略一）
宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
宏基因组（Metagenome）
• Metagenome作为一个新名词最初由美国科学家 Handelsman 及其研究组于2019年提出，定义为 “the Genomes of the Total Microbiota Found in Nature”， 即指任何特定环境样品中全部微生物 遗传物质的总和, 并且目前主要是指环境样品中细 菌和真菌基因组的总和。
宏基因组文 库
Metagenomic Library
通过PCR 或者杂 交筛选特定序列
SIGEX
通过功能筛选特 定表型的阳性克
隆
基于宏基因组分离筛选功能基因 的四个技术要素
载体 Vector
环境样品DNA制备 DNA Preparation
自然产品筛选平台
Natural Product Discovery Platform
Metagenomic library
sequence
Screen for specific sequences by PCR or hybridisation
SIGEX
Functional screening for expression of particular phenotype
细菌16S rRNA的测序分析
Environmental sample
Extract metagenomic DNA
Construct 16S (18S) rRNA gene library using PCR
Clone into vector
eg plasmid, cosmid
phosmid, BAC
Introduce into host eg E. coli
ITS 1 和ITS 2 是中度保守区域, 其保守性基本上表现为种内相对一 致,种间差异比较明显。IT S 的序列分析能实质性地反映出属间、 种 间以及菌株间的碱基对差异,此外ITS 序列片段较小、 易于分析, 目 前已被广泛应用于这种特点使ITS 适合于真菌物种的分子鉴定以及属 内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。
高通量筛选 High Throughput
Screening
Baidu Nhomakorabea
宿主Host
环境样品DNA制备
原位裂解法：将土壤样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理, 继而抽提纯 化。 此法操作容易、成本低、DNA提取率高、偏差小, 但由于强烈的 机械剪切作用, 所提取的DNA片段较小(1-50 kb)，且腐殖酸类物质也 难以完全去除。
载体
一般选用质粒、粘粒或者Fosmid 载体来构建文库，其插入片 断小于40kb, 对生物合成比较复杂的化合物，因其基因簇较大 ，则无法完整克隆。
细菌人工染色体（BAC）载体能克隆100 kb以上的大插入片断 ，完全有可能克隆到完整的代谢基因簇途径，但是其拷贝数目 和表达量低。因而可选择和改进已有的穿梭 BAC 载体来构建 文库，达到其拷贝数量可以诱导控制的目的，在必要时可诱导 增加载体拷贝数以获得大量DNA进行亚克隆和序列分析。
通过设计特异的PCR引物，扩增得到ITS序列，然后两端加上接头，便可利 用Illumilla的高通量测序技术对ITS进行测序分析，以获得环境样品中真菌 等的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。
宏基因组文库
环境样品
宏基因组文库的构建 抽提DNA 克隆(多种载体) 转化适宜宿主细菌(如大肠杆菌)
Chakravorty 等（2019）总结16S rDNA 的序列，及其中 九个9个可变区和10个保守区的位置和长度，并指出不同的 可变区适合不同菌群的鉴定分析。其中V3（约60 bp）和V6 区（约70 bp）可以分别用来鉴定大多数细菌。
16S rDNA
通过设计特异的PCR引物，扩增得到V3或V6区的序列，然 后两端加上接头，便可利用Illumilla的高通量测序技术对V3或 V6区进行测序分析，以获得环境样品中细菌等物种分类、物 种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。
16S rDNA指的是细菌基因组中编码核糖体16S rRNA 分子的对 应的DNA序列，也就是16S rRNA 的编码基因。其长度大约为 1500 bp
通过16S rDNA的测序，可以分析环境的群落构成，以及进行细 菌的分类和进化分析。
细菌16S rRNA的V3或V6区的测序分析
Ashelford 等（2019）通过对4383个细菌16S rDNA的序列 进行比对分析，表明16S rDNA 全长序列中包含9个可变区 （V1-V9）和10个保守区。其中保守区反映生物物种间的亲 缘关系，可变区则表明物种间的差异。
异位裂解法：采用物理方法将微生物细胞从土壤中分离出来, 然后采 用较温和的方法抽提DNA, 如先采用尼可登介质密度梯度离心分离微 生物细胞, 然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解, 脉冲场凝胶电泳回收 DNA。 可获得大片段DNA (20～500 kb) 且纯度高, 但操作繁琐, 成本高, 有 些微生物在分离过程中可能丢失, 温和条件下一些细胞壁较厚的微生 物DNA难以抽提出来。
真菌ITS的高通量测序分析
ITS(Internal Transcribed Spacers )，即核糖体内转录间隔 区 ，是位于 28S rDNA的3’端与 18S rDNA的 5’端之间的序列 ITS常用于真菌的分类研究，其长度一般为650-750 bp ITS包含ITS1和ITS2两个区域。其中ITS1 位于 18S rDNA和 5.8S rDNA之间，ITS2位于 5.8S rDNA和 28S rDNA之间
Metagenome VS Genome
目录
宏基因组简介 宏基因组的常用研究方法
16S (18S) rDNA测序
宏基因组文库
—功能基因筛选（策略一）
宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
Metagenomics involves constructing DNA libraries from environmental DNA
宏基因组功能基因的筛选
WCX 2019年3月17日
目录
宏基因组简介 宏基因组的常用研究方法
16S (18S) rDNA测序 宏基因组文库
—功能基因筛选（策略一）
宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
宏基因组（Metagenome）
• Metagenome作为一个新名词最初由美国科学家 Handelsman 及其研究组于2019年提出，定义为 “the Genomes of the Total Microbiota Found in Nature”， 即指任何特定环境样品中全部微生物 遗传物质的总和, 并且目前主要是指环境样品中细 菌和真菌基因组的总和。