蛋白酶的生产和应用

菌株。例如：碱性蛋白酶生产菌：液化淀粉芽孢杆菌(B．amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌
(B．1icheniformis)、黄曲霉(A．flavus)、米曲霉(A．oryzae)、栖土曲霉(A．terricola)，冠状耳霉
(Conidiolus eoronutus)
中性蛋白酶生产菌：枯草芽孢杆菌(B．sultilis)、热介蛋白芽孢杆菌
酶及其生产菌种。(根据各公司样本编制)
商品名(制造厂)
菌种
用途
碱性蛋白酶：
Alacalas(Novozymes) Protamax(Novozymes) Savinase(Novozymes) Espcrase(Novozymes) Sabtilisin(Novozymes)
Proleather FG．F(天野) Protin—A(大和化成)
Oricntase 22BF(阪急共荣)
Kazuosase(Байду номын сангаасhawa Denko)
中性蛋白酶：
种 枯草芽孢杆菌 地衣芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 芽孢杆菌
动植物蛋白质水解、制肽、可溶性鱼蛋白 食品加工、洗涤剂 食品加工、洗涤剂 洗涤剂
Protin P(大和化成) Diaskin C(大和化成) Orientase 90N(阪急共荣)
钙离子对蛋白酶的生物合成和稳定都很重要，液体培养基中添加O．5％的Ca2+。黑曲霉酸 性蛋白酶可以增加50％，短小芽孢杆菌碱性蛋白酶生产可以增加35％，可是在固体培养下， C 一+的作用并不突出。
能生产蛋白酶的微生物很多，但所用菌种必须符合FAO／WHO 食品添加剂专家委员会 JECFA(Joint FAO／WHO Expert Committee On FoodAdditives)的评估标准，在美国酶制剂生 产菌种须符合GRAS 要求。微生物的产酶能力通过各种遗传育种手段已得到大幅度提高， 雀巢公司的专利(Van Den Broek etal，USP6，090，607)(2000)报导，利用基因工程技术将 米曲霉肽酶和蛋白酶活性提高了两倍以上．潘延云等报导，用原生质融合的方法，将碱性蛋 白酶生产菌2709 与含有碱性蛋白酶基因克隆载体PDW2 的工程菌枯草杆菌BDl05 进行细胞 融合，得到一株高产蛋白酶工程菌A16，摇瓶发酵的酶活比2709 高50．100％，最高达
注：PFP．二异丙基磷酰氟 甲基磺酰氟 Ph 马铃薯蛋白酶抑制剂 EDTA：乙二胺四乙酸
PCMB：对氯汞苯甲酸 PMSF．"苯 DAN：重氮乙酰正．DL．亮氨酸甲酯 OP：郯二氮杂菲)(菲绕啉)
2．关于微生物蛋白酶的生产
蛋白酶是用途最广泛的酶制剂之一，主要用于洗涤剂，制革、毛皮、蛋白水解物、酿酒、 酱油，以及纺织、医药品、化妆品等的生产上。全球蛋白酶的销售额占酶制剂市场的60％， 我国2005 年全国(外资合资企业不计)微生物酶制剂产量约48 万吨，总销售额约20 亿 人 民币，其中蛋白酶约10 万吨，销售额近9 亿人民币。
蛋白酶的合成受分解代谢阻遏的调控，保持培养基中e／N 较低水平或通过流加碳源，将 还原糖浓度保持在阻遏浓度之下，例如碱性蛋白酶生产时保持培养液的糖浓度在O．4～1％可 获高产。将培养液PH 始终保持在6~7 之间，不论对碱性、中性和酸性蛋白酶的生产都是有 利的。
蛋白酶是一诱导酶，其生物合成受底物及其类似物之诱导，也受到氨基酸或铵盐等易利 用氮源之阻遏，但某些黑曲霉是个例外，培养基中需添加l~3％的NFhCl 或其他铵盐才有高 产．
4．我国对蛋白酶的研制概况
(1)中性蛋白酶 我国对蛋白酶的研究始于1957 年中科院微生物研究所和原轻工业部 工业试验所曾收集 和保存了一批酱油酿造用曲霉，肖永澜、方心芳等从117 株黄绿色曲霉中筛选出12 株蛋白 酶活性高的曲霉，其中以栖土曲霉3,374 的活性最强。1964 年中科院微生物所、江苏省食品 发酵研究所合作，就北微所筛选的枯草杆菌1938 蛋白酶的生产条件进行详细研究。1965 年 完成中试后于新建的无锡酶制剂厂投产，1965 年上海市工业微生物研究所对栖土曲霉3942 蛋白酶的液体和固体培养工艺条件进行了研究，笔者发现固体培养时，添加3-5％纯碱，碱 性中性蛋白酶活性可增加30％，液体培养时添加洗净剂LSO．1％，可使通风量下降50％以上， 酶活性增加60％。枯草杆菌1938、栖土曲霉3942 及放线菌166 是国内生产中性蛋白酶的主 要菌种，它们的发酵产酶水平在30 多年来的不断改进，有了不少提高。1938 的酶活由当初 的2．3 千个单位，毫升提高到现在的1．1．2 万单位，毫升，3942 由当时3 千单位提高到现在4． 5 千单位，固体培养为1．5 万单位以上，166 的产酶能力由4 千单位提高到现在的8 千．1 万单 位／毫升。
PH
例子
丝氨酸蛋白酶 DFP 9．5．10．5 ①胰蛋白酶型：切开点羧基侧 胰蛋白酶，灰色链霉
(EC3．4．21)
PMSF PI
半胱氨酸蛋白 PCM6El 7-8 酶(EC．3．4．22)
是碱性氨基酸残基之肽键： 菌，弗氏链霉菌，红霉
Lys(Arg)一
菌，链霉菌
②碱性蛋白酶型： 糜蛋白酶，枯草杆菌， 切
Protease M“Amano”
Protease PD(盛进制药) Stalase(Seishin 制药)
Protease YP．SS(Yokult)
Proctase(明治制果) Orientase 20A(阪急共荣)
Protease(Matsutani)
Denapsin
SumizymeAP(新日本) Sumizyme RP(新日本)
制革、毛皮工业 浸水、脱水、软化 明 ．
胶制造
除去胶原纤维间隙蛋白质
洗涤剂
加酶洗衣粉
烟草制造 饲料添加剂
分解烟草蛋白质，改善烟味 制加酶饲料
消化药
直接作为消化剂
消炎药 感光胶片处理
清创，消炎，祛痰止咳 回收片基，银粒
14
蛋白酶应用于洗涤剂、制革工业、裘皮工业、明胶工业、丝绸脱胶、食品工业(干酪、蛋 白质水解物脱苦和天然调味液制造、酱油生产、烤焙制品和肉类嫩化、合成二肽甜昧剂、茶 饮料生产)、酒精、酿酒和酿造醋生产、功能性肽的制造、饲料制造、I 临床治疗等。
蛋白酶也同人类生活资料的生产息息相关，涉及人类生活的方方面面，全球酶制剂市场 中蛋白酶的销售额达到60％。以下就个人多年来从事蛋白酶的生产和应用开发的一些学习 体会做一汇报与大家交流。
1．关于蛋白酶的分类与专一性(略)
表l 微生物蛋白酶的分类和底物专一性
分类
抑制 最适 优先切开的肽键(底物专一性)
剂
细菌的中、碱性蛋白酶通常是用液体深层培养法生产，而霉菌蛋白酶则更适于采用固体 培养法生产，固体培养不易污染，管理容易，节省能源，单位容器产量高，日本和欧洲不少 工厂广为采用。
微生物生产蛋白酶与生长相有关，芽孢杆菌中性蛋白酶在对数生长期同步产生，而碱性 蛋白酶则在对数生长期末芽孢形成时大量生成，芽孢形成起到产酶开闸的作用。不能形成芽 孢的突变株一般不能大量合成碱性蛋白酶，丧失蛋白酶合成能力的突变株不能形成芽孢。曲 霉固体培养时，蛋白酶活性在分生孢子老熟时达到最大值，液体培养时当菌体衰老自溶时， 蛋白酶活性达到高峰。菌种突变或培养条件变化能使产酶期或酶系组成发生变动。
Meito Rennet(Meito Sangyo)
米曲霉
黑曲霉 根霉 斋藤曲霉 雪白根霉 米曲霉(微酸性) 杜邦青霉 金黄曲霉 黑曲霉 黑曲霉 黑曲霉 米曲霉 黑曲霉 黑曲霉 雪白根霉 丝立毛霉
调味料制造
蛋白质水解、饲料 蛋白质水解、饲料 消化剂、食品加工 蛋白质水解 制HVP 食品、饲料 消化剂 蛋白质水解、制调味料 饲料添加剂、消化剂 蛋白质水解、调味料 谷物醋酿造 蛋白质水解
(B．thermoprotyolyticus)、厌色链霉菌(st．griseus)、蜂蜜曲霉(A．melleus，弱碱性)。
酸性蛋白酶生产菌：黑曲霉(A．nige0、斋滕曲霉(A．saitoi)、栗疫霉(Endothia)、米赫毛霉
12
(M．mehei)、丝立毛霉(M．pusillus)、根霉(Rhzopus ssp)． 表2 是若干市售商品蛋白
30000u／ml。基因工程改良菌种是当前最热衷的课题，工业用酶的80％已是用基因改良菌种
生产的，但作为食品添加荆用的酶在欧盟、日本是遭拒绝的，许多工厂还都标示自己的酶是
用非GMO 生产的，食品工业用产酶菌种人们还是希望是采用诱变育种手段获得，目前国际
市场上蛋白酶品种虽多，但其所用生产菌种都限于传统上食品加工用的微生物和确认无害的
地衣芽孢杆菌 地衣芽孢杆菌 地衣芽孢杆菌 嗜碱芽孢杆菌 地衣芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌变
制革、洗涤剂、食品加工 制革、洗涤剂、食品加工 洗涤剂、食品加工 洗涤剂、纺织退浆 试剂 食品加工、洗涤剂 制革、食品加工
Aroase AP．10(Yakult) Godo Bap(Godo Shusei)
基侧是碱性氨基酸残基之肽键
③链球菌型：广泛氨基酸之肽 A 群链球菌 键
金属蛋白酶
(EC3．2．23)
EDTA OP
7．9
①中性蛋白酶型：切开点氨基 枯草芽孢杆菌、热介蛋
端是疏水性氨基酸残基或任一 白芽孢杆菌、腊状芽孢
氨基酸之肽键-Leu(或Phe 及 杆菌、巨大芽孢杆菌、
其它)
灰色链霉菌、米曲霉、
铜绿色假单孢菌，介淀
奶酪制造
3．蛋白酶的利用 蛋白酶的用途非常广泛(表3)，最大的用户是洗涤剂，其次用于饲料、食品工业、酿
酒酿造，以及制革工业和医药。
用途
说明
表3 蛋白酶的用途
干酪制造
凝固酪蛋白，缩短成熟时间 酱油酿造
预处理大豆，提高蛋白质利用率 天然调
味液制造
水解蛋白质，增强风昧，制HVP、HAP
酒精，酿酒
水解蛋白质，促进酵母发酵
Protease A Flavourzyme(Novozyme)
Protease IP(盛进制药) Sumizyme LP(新日本) Sumizyme LPL(新日本) Sumizyme FP(新日本) Sumizyme MP(新日本)
Protease P“Amano”6
米曲霉 曲霉 酱油曲霉 米曲霉 米曲霉 米曲霉 蜂蜜曲霉 蜂蜜曲霉
Thermoase(大和化成) Therrnolysin(大和化成)
菌 芽孢杆菌 热解蛋白芽孢杆
耐热性蛋白酶、合成肽等 试剂、耐热性蛋白酶、合成肽等
Protease A“Amano”2
Protease M“Amano” Umamizyme(天野)
菌 米曲霉 米曲霉 米曲霉
含肽酶多、天然调味料 婴儿乳品降低过敏性、调味料 风味酶、调味品
开点羧基侧是芳香族或疏水 面包酵母，灰色链霉 性
氨基酸残基之肽键： 菌，直丝链霉菌，米曲
√rrp(Tyr，Phe，Leu)一
霉
③其它：粘细菌Y 一裂解型和葡
萄球菌型
①木瓜蛋白酶型：切开点羧基 木瓜、无花果、菠萝、
侧是任一氨基酸残基之肽键： 组织蛋白酶
-Phe(或Val，Leu)一Xaa_
②梭状菌蛋白酶型：切开点羧 溶组织梭状芽孢杆菌
啤酒澄清 酿醋
分解啤酒单宁蛋白沉淀，延长保质期 缩短酿醋周期，增加食醋得率
茶饮料
分解茶汤蛋白质，改善过滤性，增强香味和稳定性 烤焙
食品
分解面筋蛋白，软化面团，缩短揉面时间，增加延伸性
肉类加工
嫩化，肉骨处理，制骨汤
’ 生理活性肽制
造
水解动植物蛋白质制生理活性肽
生化制药 蛋白胨制造
制脏器水解物，水解蛋白等 水解蛋白质
蛋白酶的生产和应用
上海工业微生物研究所
胡学智
蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，是酶学研究中较早也是最深入的一种酶。到本世纪 初，已经报导的微生物蛋白酶估计超过900 种，生物体的生理活动和疾病的发生如食物之消
化吸收、血液之凝固、溶血作用、炎症、血压调节、细胞分化自溶，机体衰老、癌症转移、 生理活性肽的活化等，莫不同蛋白酶有关．
粉芽孢杆菌、溶组织梭
状芽孢杆菌
②其它：粘杆菌蛋白酶
天门冬氨酸蛋 DAN 2．5 白酶
切开点两端是芳香族或疏水性 米曲霉、黑曲霉、点青 氨基酸残基之肽键：．Phe(或 霉、华根霉、微小毛霉、
(EC3．2．24)
Tyr，Leu)-Trp(或Phe，伽) 米赫毛霉、栗疫霉、白
色念珠菌、面包酵母、 粘红酵母
食品、饲料加工
蛋白质水解、脱苦、调味液
食品饲料加工
动植物蛋白水解、面包、发酵食品
面包制造
。·
动植物蛋白水解、调味液
弱碱性蛋白酶、调味液
水解蛋白质
Actinase(科研医药)
灰色链霉菌
试剂、食品加工、医药
13
Pantiase NP-2(Yokult)
酸性蛋白酶： SumizymeAP(新日本) Sumizyme RP(新日本) Molsin(Seishin 制药) Neulase F(天野)
Neutrasc(Novozymes)
Spezyme FAN(杰能科)
Protease N“Amano” Protease NL“Amano” Protease S“Amano”
枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌
解淀粉芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 脂肪嗜热芽孢杆
降低蛋白质黏度、蛋白质加工 乌贼鱼剥皮 蛋白质加工、制肽、调味料、蛋白质水解 分解面筋蛋白、面包、饼干生产、蛋白质 水解 水解蛋白质、酒精发酵 水解乳清蛋白、制奶酪 水解乳清蛋白、制奶酪 高温水解蛋白质