基因诊断与基因治疗

Leber 病患者 PCR/SSCP分析
PCR/等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide， ASO)
（三）基因测序
即测定DNA序列的技术。分离患者的有关基因， 测定出碱基排列顺序，找出其变异所在，是最 确切的基因检测方法。 目前用于测序的技术主要有Sanger等发明的双 脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert发明的化 学降解法。
RLFP分析法
（二）聚合酶链反应 (PCR)
PCR/单链构象多态性分析 (single strand conformation polymorphism, SSCP)
PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正 常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确 定致病基因的存在。
﹣
+
正常人
纯合突变 杂合突变
2、体细胞（somatic cell）基因治疗
是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因 产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传 给后代。
四、基因治疗方式
一、体内疗法（in vivo、一步法） 将携带有治疗基因的载体直接导入体内有关的组 织器官，使其进入相应的组织并进行表达。
二、体外疗法（ex vivo、二步法） 先把待接收基因的靶细胞从体内取出，将携带有 治疗作用的载体导入培养细胞内，筛选、增殖， 再回输体内有关组织中。
3、目前基因治疗的方案多数是采用ex vivo 方法，但 受体细胞经体外长期培养和增殖后，细胞生物学特 性是否改变也是值得研究的问题。
4、要充分估计导入外源基因对机体的不利影响。
目前广义上来讲是指将某种遗传物质转 移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以 达到治疗疾病目的的方法。通过基因水平的 操作而治疗疾病的方法。
二、基因治疗的策略
1、基因修正（gene correction） 2、基因替代（置换） （gene replacement） 3、基因增强（补偿） （gene augmentation） 4、基因抑制（gene constraint）和/或
包装细胞：一种细胞，重组逆转录病毒载体只能在 其中包装成没有感染能力的病毒颗粒，但能从中释 放出去，这种细胞即包装细胞。
1.多数由各种辅助病毒转染小鼠成纤维细胞系 NTH3T3构成。 2.辅助病毒由MoMLV切除了病毒5’端LTR至Gag起 始密码之间包装信号ψ等序列，虽能产生病毒蛋白 但不能进行包装。 3.导入的逆转录病毒载体转录出的RNA可以利用辅 助病毒产生的病毒蛋白包装成假病毒颗粒。
五、基因治疗的基本程序
目的基因+载体 ↓
重组DNA ↓
受体细胞 ↓
外源基因表达的筛选 ↓
回输体内
（一）目的基因的选择原则
1、为致病基因 2、遗传分子机制清楚 3、该基因已被克隆，一级结构和表达调控机
制清楚 4、可在体外操作，而且安全有效 5、转移基因能完整地、稳定地整合，并能适
时适量表达
目的基因的来源
length polymorphism, RLFP)分析 等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific
oligonucleotide, ASO)
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)
5´
3´
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ1.15kb
正常基因
×
5´
3´
1.35kb
突变基因
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
（三）载体的选择和外源基因的导入
病毒载体 RNA病毒载体（逆转录病毒） DNA病毒：常用的有腺病毒、疱疹病毒、
SV40病毒、巨细胞病毒、 腺相关病毒、单纯疱疹病毒等 非病毒载体 质粒、脂质体、受体介导的蛋白
逆转录病毒（retrovirus）
目前应用最多的最成功的是逆转录病毒，病毒感 染细胞后，其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA 拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus）， 前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒 编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。 完整的病毒颗粒具有插入宿主染色体必需的全套 酶系统，适用于介导基因转移。
基因失活（gene inactivation） 5、免疫基因治疗 6、活化前体药物基因（自杀基因）治疗 7、耐药基因治疗
三、基因治疗的种类
1、生殖细胞（germ cell）基因治疗
理论上将正常细胞基因转移到患者的生殖细胞 （精细胞，卵细胞早期胚胎）使其发育成正常 个体。这是理想的治疗方法，从根本上治疗遗 传病，使其有害基因不能在人群中播散。
第二十一章
基因诊断与基因治疗
Genetic Diagnosis and Gene Therapy
基因变异致病类型
内源基因的变异
由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影 响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发 生异常，从而导致疾病。
外源基因的入侵
如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入 人体并在体内增殖而引起各种疾病。
GCV（胸苷类似物）
P GCV---p 抑制DNA合成
TdR p
脱氧胸苷酸
肿瘤细胞死亡
邻近细胞死亡/凋亡（旁观者效应）
（三）艾滋病的基因治疗
（四）心血管疾病、神经系统疾病等 其它领域中的应用
1、基因治疗要获得成功，必须具备切实有效的目的 基因。
2、外源基因在人体内的表达调控存在一定的问题， 尽管目前已有多种基因载体可供选择，但如何扬长 避短，构建安全、高效、靶向、可控的载体是亟待 解决的问题。
（四）基因芯片
基因芯片(gene chip)（又称DNA芯片、生物芯片） 通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列 测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八 核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列 与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时， 通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列 完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。 应用领域:基因表达谱分析、基因突变及多态性分析、 基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基 因测序等。
逆转录病毒载体的优点
1.可插入足够长的外源DNA（7KB） 2.基因转移效率高，几达100% 3.重组体可整合入宿主染色体，并稳定表达和传代 4.宿主范围广、比较安全
缺点
1.只能整合入分裂活跃的细胞 2.靶细胞表面需要有特殊的受体 3.必须使用带有“辅助病毒”的包装细胞系 4.病毒滴度低
包装细胞系
1、基因组DNA文库 2、cDNA（complementary DNA） 3、人工合成基因片段 4、PCR扩增
（二）受体细胞的选择原则
1、最好选择组织特异性细胞 2、容易取出 3、具有较长的寿命 4、离体细胞能高效导入目的基因 5、经体外操作后能存活并安全回输
常用的的受体细胞： 淋巴细胞、造血干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细 胞、骨骼肌细胞、血管内皮细胞、呼吸道上皮 细胞、肿瘤细胞。
﹣
1.35kb 1.15kb
0.2kb
+
正常人 突变携带着 患者
DNA限制性片段长度多态性（RFLP）
在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异， 中性变异导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多 态性。不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点 上，酶解该DNA片段就会产生长度不的片段，称为限 制性片段长度多态性。在某一特定家族中，如果某 一致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可利 用这一多态性片段作为一种“遗传标志”，来判断 家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。
第一节
基因诊断
Gene Diagnosis
一、基因诊断的概念、内容和特点
定义: 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方
法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常， 从而对疾病作出诊断的方法。
前提条件： 已明确疾病表型与基因型的关系。
基因诊断的基本内容
检测个体基因序列特征 基因突变分析 测定基因拷贝数 基因表达产物分析 测定是否存在外源基因
如将肿瘤坏死因子（TNF）基因导入TIL。 这是目前肿瘤基因治疗最常用的方法。 3.肿瘤细胞的修饰
如： 自杀基因 + 病毒载体
转染 重组载体
药物前体 (无毒) Gene→酶→ ↓
药物复合物(有毒)
细胞死亡
例如：
单纯疱疹病毒
哺乳动物细胞
HSV Gene-TK
（在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）
Gene—TK
内源基因的变异
由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影 响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发 生异常，从而导致疾病。
外源基因的入侵
如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入 人体并在体内增殖而引起各种疾病。
二、基因诊断常用技术方法
（一）核酸分子杂交技术
限制性内切酶谱分析法 DNA限制性长度多态性(restriction fragment
（四）外源基因表达的筛选
在较多的表达载体中都有neor标记基因存在， 若向培养基中加入药物G418，未被转化的细胞 不存在neor标记基因，细胞不能存活，最后只 有转化细胞存活下来。
（五） 回输体内
四、基因治疗的应用
（一）遗传病的基因治疗
遗传病基因治疗的必要条件
1.选择合适的疾病：单基因遗传病 2.具备该病分子缺陷的知识 3.有目的基因的克隆 4.克隆基因的有效表达 5.克隆基因的有效调节 6.可利用的动物模型
基因治疗的部分对象
1.严重联合免疫缺陷症（腺苷脱氨酶ADA缺乏） 2.囊性纤维变性 3.Gaucher病Ⅰ型（葡糖脑苷脂酶缺陷） 4.苯丙酮酸尿症（苯丙氨酸羟化酶缺陷） 5.血友病B（凝血Ⅸ因子缺陷） 6.家族性高胆固醇血症 7.地中海贫血
（二）肿瘤的基因治疗
1.宿主的修饰：保护分裂旺盛的正常组织，如 造血干细胞：导入二氢叶酸还原酶基因，获 得对氨甲蝶呤的抗性 2.增强肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）活性：
逆转录病毒载体的构建
1、主要来自莫洛尼氏小鼠白血病病毒 （Moloney murine leukemia virus，MoMLV）其中 三个结构基因（gag、pol、env）被删除 2、标记基因（marker gene）插入空缺，供阳性 选择用。如：新霉素抗性基因（neomycin resistant gene），该基因编码新霉素磷酸转移酶 Ⅱ（NPTⅡ），能对抗新霉素（G418）。 3、有目的基因的插入位点
特点:
1.以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊 断”，针对性强。 2.分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，故具 有很高的特异性。 3.由于分子杂交和聚合酶链反应（PCR）技术都具有 放大效应，故诊断灵敏度很高。 4.适用性强，诊断范围广。 5.检测外源基因时，可以检测出潜伏的病原体。
基因变异致病类型
三、基因诊断的应用
遗传性疾病 肿瘤 感染性疾病，传染性流行病 判断个体疾病易感性 器官移植组织配型 法医学中个体识别、亲子鉴定
第二节
基因治疗
Gene Therapy
一、基因治疗的概念
定义
早期是指将外源正常基因导入靶细胞， 整合入细胞基因组，纠正或补偿因基因缺陷 和异常引起的疾病以达到治疗的目的一种治 疗方法。