荧光探针在蛋白质研究中的应用

第13卷　第3期1998年6月荧光探针在蛋白质研究中的应用
Ξ王守业　余华明　张祖德　刘清亮
(中国科技大学化学系　合肥230026)
大学化学
摘要　荧光探针技术是研究蛋白质在水溶液中构象的一种有效方法。

利用它可以测定蛋白
质分子的疏水微区内两基团的距离以及酶与底物结合过程中蛋白质构象的变化等。

本文综述了荧光探针技术在蛋白质研究中的一些进展。

一、　引言
荧光探针技术是利用物质的光物理和光化学特性,在分子量级上研究在溶液中蛋白质构象的一种方法。

该方法的最大特点是具有高度的灵敏性和极宽的动态响应范围。

荧光探针物质之所以可被用来研究蛋白质的构象,主要是因为其具有特殊的光物理性质,如在不同极性介质中有着不同的光谱特性(即不同的峰值波长),不同的荧光量子产率和荧光寿命等。

因此,测定荧光探针物质和蛋白质分子结合后荧光峰波长、位移及量子产率的变化,就可探知其所处微环境的极性及其他有关性质。

利用荧光探针技术研究蛋白质在溶液中的构象有两种方法:一种是测定蛋白质分子的自身荧光,即“内源荧光”,另一种是利用荧光探测剂,即“外源荧光”。

若引人的荧光探测剂为有机分子,则该分子叫做有机荧光探针;若引入的荧光探测剂为稀土离
子(如铽(Ⅲ)、铕(Ⅲ
)等),则该离子叫做稀土离子荧光探针。

二、　荧光探针的某些光物理和光化学特征
1.　有机荧光探针的某些特征
最常用的有机荧光探针物质有12苯胺基萘282磺酸(ANS ),22对甲胺萘262磺酸(2062TNS )和12N 0N 2二甲胺基萘252磺酸(1052DNS )(dansyl acid ),其结构如图1:θθSO -3
N θH θθSO -3N H θ
H 3C θθS O O
Cl
N H 3C CH 3
1,82ANS 2,62TNS 1,52DNS 2Cl
图1　1082ANS,2062TNS 和1052DNS 2Cl 的结构
这些化合物在水溶液中基本不发荧光,量子产率低(低于0.1),但在非极性溶剂中,其量子产率大增,荧光峰蓝移,且能和许多蛋白质结合。

这种探针分子溶液的荧光光谱因溶剂极
Ξ本文为国家自然科学基金资助项目。

性改变而变化的现象称为溶剂致变色效应(solventochromism).利用这些化合物在不同蛋白质分子中量子产率、峰位及谱带的变化,就可探测蛋白质分子结合区的极性、疏水性的大小,从而推论构象的稳定情况及变化等。

2.　稀土离子荧光探针的某些特征[1,2]
铕(Ⅲ)和铽(Ⅲ)是最常用的两种稀土荧光探针。

图2是铕(Ⅲ)和铽(Ⅲ)的荧光光谱[3]。

铕(Ⅲ)和铽(Ⅲ)的最大荧光峰分别出现在612nm和545nm处,分别对应于5D0→7F2和5D4→7F5跃迁。

图2　0.01mol/L Eu(Ⅲ)(a)和Tb(Ⅲ)(b)的荧光光谱
铽(Ⅲ)和铕(Ⅲ)f电子的激发方式有两种,即直接激发和间接激发。

488nm的激光光源可使铽(Ⅲ)发生7F6→5D4跃迁,这种激发方式为直接激发。

若通过激发邻近发色团,发色团将能量转移到铽(Ⅲ)和铕(Ⅲ)而使其激发的方式为间接激发。

铽(Ⅲ)和铕(Ⅲ)荧光光谱的高灵敏性和不同环境对荧光的影响等,使得铽(Ⅲ)和铕(Ⅲ)成为研究蛋白质的有效探针。

三、　利用荧光探针研究蛋白质活性部位微环境
作为一个好的荧光探针应满足以下条件[4]:①探针分子与蛋白质分子的某一微区必须有特异性的结合,并且结合比较牢固;②探针的荧光必须对环境条件敏感;③蛋白质分子与探针结合后不应影响其原来的结构和特性。

在满足这些条件的基础上可进行:
1.　在不均匀体系中结构类型分布的研究
ANS、TNS、DNS这一类极性荧光探针的荧光特性对周围介质的极性十分敏感。

根据这一特点,早期的研究曾用ANS作荧光探针研究了肌红蛋白和血红蛋白的血红素结合微区。

Prasad用Bis2ANS作荧光探针研究微管蛋白(Tubulin)[5],确定了Bis2ANS在微管蛋白上有两个结合部位,测得两个结合部位的解离平衡常数分别为217μm和2212μm。

Prasad的研究表明:当Bis2ANS等有机探针与蛋白质结合后,蛋白质上的Trp残基可将吸收的能量无辐射地转移到Bis2ANS等上。

除了ANS、TNS、DNS等对环境敏感的萘衍生物类探针外,Weber还合成出了另一类对
环境敏感的萘衍生物探针[6]:62丙酰基222(N0N2二甲胺基)萘(FRODAN),22(N0N2二甲胺基)262萘酰242反2环己酸(DANCA)等。

其结构如图3:
θθN
CH3
CH3
C O
R
FRODAN:R=—CH2CH3
DANCA:R=COOH 图3　FR ODAN和DANCA的结构
这些有机荧光探针就其结构而言,都有较大而明确的激发态偶极距。

Lasagna等用FRODAN和DANCA作荧光探针研究了辣根过氧化物酶的血红素结合部位。

Tolasa和Leah[7]最近设计并合成了一系列通式为Ar(2CH2)n2Q的荧光探针,这些具有双发色团的分子可与蛋白质形成氢键,产生疏水作用和静电作用,可用以研究这些探针的蛋白质结合性质,已用这些探针研究了血清蛋白和钙调蛋白。

当芘基探针PBAC(n=4,Q=N H+4)和钙调蛋白结合时,两芘基发色团分别结合在钙调蛋白的两相邻微区,引起钙调蛋白构象发生转变,此时PBAC形成一激态分子。

按照F ster偶极2偶极无辐射能量转移机理,结合在不同蛋白质上的铽(Ⅲ)与结合在同一蛋白质不同结合部位铽(Ⅲ)会有不同程度的铽荧光敏化。

正是这一特点可使我们利用稀土荧光探针研究蛋白质分子中金属离子结合部位的差异。

如含Trp残基的蛋白质内的钙(Ⅱ)结合的分类研究[8,9]。

铕(Ⅲ)的7F0→5D0跃迁为单线态到单线态的跃迁,若体系中所有的铕(Ⅲ)处于相同的环境,则对应于7F0→5D0跃迁激发峰为单峰,即监测激光诱导的7F0→5D0诱导激发峰形,可确定金属离子结合部位微环境是否相同。

如Mulqueen等利用Eu(Ⅲ)的7F0→5D0激发峰研究了钙调蛋白[10],结果表明Eu(Ⅲ)和钙调蛋白有两个强结合部位和两个弱结合部位。

2.　特定结合部位微环境研究
当一个分子的发射光谱和另一分子的吸收光谱相重叠时,通过分子间偶极2偶极的共振偶合可使能量从给体转移到受体。

按照F ster理论,能量给体和能量受体间距离r与能量转移效率为50%时所对应的临界能量转移距离R0及能量转移效率E之间有如下关系:
r=R0(E-1-1)1/6(1)其中:R06=8178×10-25K2φn-4J(2) K2是和能量给体及受体跃迁矩相互取向有关的因子;n是溶剂的折射率;φ为当无受体存在时能量给体的荧光量子产率;J为光谱的重叠积分,且有:
J=∫F(ν)ε(ν)ν-4dν
∫F(ν)dν(3)
F(ν)为能量给体的荧光强度;ε(ν)为能量接受体的摩尔消光系数,单位是(mol/L)-1 cm-1;ν是波数,单位是cm-1。

由临界转移距离R0(在计算R0时可认为能量给体与受体间相互取向是无规则的,此时因子K2=2/3)和实验测得的能量转移效率E就可测出能量给体与受体间的距离r。

在早期生化研究中曾对胰朊酶分子中的Trp与标记的丹酰(Dansyl)基两者之间的能量转移效率降低
进行过研究。

这意味着在给体形成时,酶的构象发生了变化,导致它们间距离的增大,使能量转移效率降低。

又如Horrocks等测得嗜热菌蛋白酶中Trp残基与结合的铽(Ⅲ)间距离为0199nm[11],与X2ray衍射测得的0191nm很吻合;本课题组夏文胜等测定出皖南尖吻蝮蛇蛇毒中纤溶组份(FP)中Trp残基和结合的铽(Ⅲ)之间的距离为01566nm[12]。

水分子的振动可吸收铽(Ⅲ)和铕(Ⅲ)的激发能,即水分子使稀土离子激发能转移。

由于O—H的振动比O—D振动更有效地吸收铽(Ⅲ)和铕(Ⅲ)的激发能,在H2O和D2O的混合溶剂中,稀土离子激发态寿命随着H2O的摩尔分数的增加而缩短。

因此,比较稀土离子在H2O 和D2O中的激发态寿命可计算它们第一配位球上的水分子数。

Burroughs[13]比较了Eu(Ⅲ)结合caicineurin2B(CaN2B)后在H2O和D2O中激发态寿命,计算出Eu(Ⅲ)第一配位球上的水分子数为312±015和115±015,后者很可能代表4个Eu(Ⅲ)结合部位的平均值。

由于螯合剂与水合稀土离子络合时使稀土离子脱水,测定稀土离子的配位水分子数可确定蛋白质分子所提供的配位原子数。

另外,酸度影响Tb(Ⅲ)与蛋白质结合,通过观察p H对Tb(Ⅲ)荧光强度的影响,可得到蛋白质与Tb(Ⅲ)结合基团种类的信息。

3.　金属离子与蛋白质结合的计量化学
这方面的研究主要是利用稀土荧光探针。

通常利用Scatchard作图法处理荧光滴定数据,可解出蛋白质分子的金属离子结合部位数和结合常数。

如E pstein等对猪胰蛋白酶的研究[14],结果表明:稀土离子和猪胰蛋白酶有两个结合部位。

用Scatchard作图法测得Gd(Ⅲ)和猪胰蛋白酶的高亲和结合部位的结合常数为800mol-1・L。

从化学平衡过程来看,若蛋白质分子具有一个或一个以上相同的相互独立的稀土离子结合部位,由此得到的结合常数是可靠的;若蛋白质分子具有两个或两个以上不等价的稀土离子结合部位,由此得到的只是一个近似的估计结果。

如Breen等进行的各种离子在小白蛋白(parralbumin)中钙结合部位的结合以及关于钙调蛋白的类似研究[15],由各种稀土离子在钙调蛋白的钙(Ⅱ)结合部位的相对结合常数可知;稀土离子中钕(Ⅲ)的结合最牢固,这与钕(Ⅲ)的离子半径和钙(Ⅱ)的离子半径最接近这一事实相吻合。

四、　利用偏振荧光对蛋白质进行研究
荧光偏振在蛋白质荧光技术中是一个很重要的方面。

荧光偏振可用下式来计算:
P=F∥-F⊥/F∥+F⊥(4)式中F∥和F⊥分别为与激发光偏振平面相平行和相垂直的偏振发光强度。

当P等于零时,即为完全不偏振;而当P在-1和+1之间时,即为部分偏振,这种去偏振现象可以说明发射体在激发态的信息。

当面偏振光与被叫做电偶极矩(electric dipole moment)的发色团的特定轴平行时,生色团对偏振的吸收最大,通常生色团是任意取向的,所以吸收偏振光的几率是和cos2θ成正比的,这里θ是偏振面和电偶极矩的夹角,发射荧光的面偏振不是用吸收偶极矩(absorption dipole moment)测定的,而是用跃迁偶极矩(transition dipole moment)测定的(跃迁偶极矩通常和吸收偶极矩不平行),所以P总是小于1,故被叫做荧光去偏振,增加去偏振程度的两个最重要的因素是吸收体的运动和生色团之间的能量转移。

通过去偏振的测量,可得到发射体分子的大小、形状等信息。

利用偏振法可间接测量荧光寿命。

荧光寿命在蛋白质荧光研究中是一重要的参数,它在
分子之间相互作用的动力学方面,可给出许多重要的信息。

可用Perrin 公式计算荧光寿命:
(1/P ±1/3)=(1/P 0±1/3)(1+3τ0/ρ0)
(5) 式中P 是分子有旋转运动时测量的偏振;P 0是分子无旋转运动时的极限偏振;τ0是寿命;ρ0是旋转弛豫时间。

对于一球状粒子ρ=3ηV /K T ,式中η是粘滞系数。

蛋白质分子的内源荧光团的寿命通常比较短,故常利用外源荧光团来检测偏振。

利用荧光偏振可研究:①酶与荧光底物的结合程度。

如果结合得紧,结合后大分子弛豫时间长,荧光偏振就大,反之,驰豫时间短,荧光偏振小。

②蛋白质的聚合与解离。

当蛋白质自缔合时,由于大分子尺寸增加,迁移率减小,α2胰凝乳蛋白酶蛋白质的DNS 2衍生物荧光偏振增加。

③蛋白质从螺旋到无规卷曲的研究,若荧光探针物质可结合到蛋白质上而不影响构象,则在蛋白质伸展时,由于桡性增大,故偏振变小。

另外,利用荧光偏振还可得到一些通常由CD 和UV 所得不到的有关蛋白质柔性微区的信息[16]。

五、　蛋白质构象的研究
Bis 2ANS 结合在蛋白质的疏水表面时,该化合物的荧光对结合部位的极性十分敏感。

作为荧光探针,早已广泛用于蛋白质的构象转变。

如Arbelaez [16]用Bis 2ANS 作荧光探针研究了孕区蛋白(pregnancy zone protein ,PZP )的构象。

研究者利用Bis 2ANS 研究了天然PZP 和用甲胺处理的PZP 构象的差别以及用胰凝乳蛋白处理的PZP 的二聚体和四聚体构象的差别。

结果表明:用甲胺处理的PZP 和天然的PZP 的构象差别不大,当胰凝乳蛋白酶解离了PZP 的解蛋白敏感区(所谓的bait region )时,PZP 的构象有明显变化,且四聚体内的二聚体2二聚体相互作用并不发生在疏水部位。

近年来,生物合成法已用于合成一些荧光探针,并将其引入到合成的活体蛋白质中。

这种方法将一些具有异常空间和电学性质的非天然氨基酸定位取代蛋白质中的相应氨基酸,用于研究蛋白质的折叠、稳定性、构象转变以及蛋白质之间的相互作用等。

Cornish 将72氮杂色氨酸(Z 7Trp )定位引入到噬菌体T4溶菌酶(T4L ),研究了T4L 蛋白质的结构和动力学特点[17],结果表明大的疏水氨基酸Z 7Trp 和小的疏水氨基酸(如环丙基甘氨酸)或带电荷的氨基酸(如高谷氨酸)相比,可更有效地插入到T4L 蛋白分子。

Z 7Trp 可插入到T4L 分子表面和内部的几个部位,对T4L 总的结构和活性都基本没有影响。

用Z 7Trp 定位取代T4L 上的Trp 2138,而Trp 2126和Trp 2158保持不变,则T4L 的最大发射峰(λex =288nm )变宽且有大约10nm 的红移,但其谱图却难以解析。

Yamamoto [18]用N 2(92吖啶基)顺丁烯二酰亚胺(NAM ,见图4)作为荧光探针,研究了植物色素在红光吸收态(Pr )和远红光吸收态(Pfr )的光转变过程的构象变化。

ANS 也可作为植物色素构象转变的荧光探针,但ANS 和NAM 在植物色素中的结合部位不同,因而这两种荧光探针可探测到发生在同一蛋白质不同微区的构象变化。

N N O O 图4　NAM 的结构 利用稀土荧光探针是研究蛋白质构象的一种新途径,铽(Ⅲ
)5D 4→7F J 及铕(Ⅲ)5D 0→7F J 跃迁对应的荧光强度较弱。

由于能量是以无
辐射形式从蛋白质转移到铽(Ⅲ)、铕(Ⅲ),因而使铽(Ⅲ)、铕(Ⅲ
)荧光增强,而蛋白质分子的内源荧光得到淬灭。

如果没有蛋白质分子构象的变化,铽(Ⅲ)、铕(Ⅲ
)对蛋白质分子内源荧光的淬灭作用是很小的。

若铽(Ⅲ)、铕(Ⅲ
)与蛋白质结合后导致蛋白质内源荧光有较大的淬灭,
多为稀土离子引起的构象变化。

若底物与蛋白质(酶)结合只改变蛋白质的构象,并不影响铽(Ⅲ)、铕(Ⅲ)在蛋白质中的结合部位,则可通过对比蛋白质结合前后能量给体2受体间距离的改变观察其构象变化,如对比人血清白蛋白结合苯甲二氮　前后其214位Trp残基与结合铽(Ⅲ)间的距离。

六、　结束语
荧光探针技术是研究溶液中蛋白质构象的一种很有效的手段,其测定条件更接近生命体的生理环境,因而比X2ray衍射测得的蛋白质粉末晶体样品数据更有说服力。

因而,荧光探针在蛋白质乃至生命科学研究中具有重要意义。

参　考　文　献
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