从植物分离产紫杉醇的内生真菌的研究
微生物发酵生产紫杉醇研究进展
微生物发酵生产紫杉醇研究进展摘要：综述了微生物发酵生产紫杉醇的主要研究进展，包括产紫杉醇的内生真菌的生物多样性、真菌细胞发酵生产紫杉醇的优势，同时也对如何改良内生真菌菌种性能和优化培养基组成及培养条件以提升其产紫杉醇的能力，作出了较为全面的综述。
关键字：紫杉醇，微生物发酵，内生菌，产量前言：目前国外市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮中提炼和人工合成方法，目前并未见有第三种形式形成大规模产业化制作的报道。
紫杉醇的生产受着原材料与科技二个方面的约束，短期内无法突破。
为克服红豆杉资源匮乏和紫杉醇需要量的日益扩大的问题，人类对生产紫杉醇开展了多种多样的科学研究，涉及化学全合成、植物细胞培养、微生物转化和微生物发酵。
微生物发酵法生产紫杉醇由于具备突出优点，其研制与发展日益引起中外科研学者的普遍重视。
一、紫杉醇产生菌的研究进展（一）产紫杉醇的内生真菌的种类Stierle和Strobel等首次从短叶红豆杉的树枝上分离出一个可以形成紫杉醇的内生真菌，命名为安德列亚霉[1]。
当时这一发现对于紫杉醇的药源研究是一次重要的突破，为开发紫杉醇的物源提出了一个崭新的途径。
此后，各地研究者相继进行对产紫杉醇的内生真菌的分离操作，先后在西藏红豆杉、云南省红豆杉、东北地区红豆杉、欧洲红豆杉和中国红豆杉中分离到能形成紫杉醇的内生真菌，其寄主植被基本包括红豆杉属下的所有种类。
在国外的树木中，科学家也分离出来到了可形成紫杉醇的内生真菌。
Li等在不同种类的秃柏的韧皮部和木材部中均分离出能形成紫杉醇的内生真菌[2]。
GA等18人在同一种松树中分离出产紫杉醇的内生真菌。
这表明，产紫杉醇的内生真菌不但存在于红豆杉属植被中，在某些非红豆杉属植被中也存在，他的研究结果更拓宽了产紫杉醇的内生真菌的研究范畴。
（二）真菌发酵制备紫杉醇的优越性与过去在红豆杉植株的树皮上获得的紫杉醇比较，由内生真菌发酵制备紫杉醇有着更多的优越性，微生物发酵方法具有以下特点：（1）微生物发酵的方法易扩大化，有利于工业化生产的落地实施；（2）微生物易于通过诱变育种等方法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量，微生物育种及选育速度明显高于植物细胞株；（3）内生真菌生长迅速，在简单培养基中便可大量繁殖，形成丰富的发酵活性性质；（4）内生真菌在生物反应器中生长时，可人为调节各项发酵参数，使代谢路径朝着有利于紫杉醇的生产及高浓度紫杉醇的积累的方向进行。
紫杉醇产生菌分离的研究
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究报道。
２．３因为这些菌株均经无红豆杉枝叶浸汁的培养 基连续传ｌＯ代后再进行发酵培养（发酵培养基中也 无该浸汁），所以其Ｔａｘｏｌ完全是来自于菌体的代谢 产物，而与原树木毫无关系。菌株的产Ｔａｘｏｌ水平
远高于Ｔａｘｏｍｙｃｅｓ ａｎｄｒｅａｎａｅ（Ｓｔｉｅｒｌｅ
ｅｔ
ａｌ
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南方红豆杉产紫杉烷类化合物内生真菌的分离与遗传转化研究
南方红豆杉产紫杉烷类化合物内生真菌的分离与遗传转化研究紫杉醇是一种二萜类的生物碱,最初从太平洋短叶红豆杉(Taxus brevifoliaNutt.)的树皮中分离到,研究发现紫杉醇对包括卵巢癌在内的多种癌症具有良好疗效。
由于紫杉醇在树皮中含量很低并且提取过程繁琐,因而价格昂贵,很大程度上限制了紫杉醇的应用。
随着紫杉醇的需求日益增长,紫杉醇的供求矛盾也日益突出,这促使人们尝试各种途径扩大紫杉醇的来源。
自从1993年Stierle首次从红豆杉树皮中分离得到一株产紫杉醇真菌Taxomyces andreanae以来,越来越多的产紫杉醇内生真菌被分离出来,这为人们通过微生物发酵大规模工业生产紫杉醇提供了可能。
本研究从安徽石台县仙寓山一株百年野生南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)树皮中,分离得到一株产紫杉醇重要前体物质巴卡亭Ⅲ的内生真菌。
经过形态学和分子生物学鉴定,将该真菌鉴定为拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis sp.),并命名为TL9。
通过单因素和4因素3水平正交实验确定了该真菌的最佳碳源和氮源,进而优化真菌的发酵培养基。
以分离得到的真菌为材料,根据南方红豆杉紫杉醇合成途径关键酶10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10p-乙酰转移酶(DBAT)的基因dbat的序列(AY365031.2)设计引物,同源克隆得到一段长为706bp的片断,经BLAST序列比对确认为真菌dbat基因的核心片断,然后通过反向PCR技术,扩增得到一段长为753bp的片断,经过序列分析后与核心片断进行拼接,得到一段长为1281bp的片断。
序列比对显示该片段与红豆杉植物dbat基因相似度达到97%,因此确认为真菌dbat基因的核心片断。
以真菌TL9为材料,测定真菌的生长曲线,确定处于对数生长期中期(约4天左右)为制备原生质体的最佳时间。
通过选择合适的酶,调整酶的作用温度和作用时间,优化原生质体的制备流程。
真菌发酵法生物合成抗癌药物紫杉醇的研究
真菌发酵法生物合成抗癌药物紫杉醇的研究真菌发酵法生物合成抗癌药物紫杉醇的研究一、引言癌症是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病之一，寻找有效的抗癌药物一直是医学和生物学领域的研究热点。
紫杉醇作为一种重要的抗癌药物，具有独特的作用机制和显著的临床疗效。
传统的紫杉醇提取方法主要依赖于从红豆杉属植物中提取，然而红豆杉生长缓慢，资源有限，这限制了紫杉醇的大量生产。
因此，探索新的紫杉醇生产方法具有重要的现实意义。
真菌发酵法生物合成紫杉醇作为一种有潜力的替代方法，受到了广泛的关注。
二、紫杉醇的结构与作用机制1. 紫杉醇的化学结构紫杉醇是一种复杂的二萜类化合物，其分子结构包含多个手性中心和独特的官能团。
它的基本结构由紫杉烷环和侧链组成，紫杉烷环是一个刚性的四环结构，侧链则连接在紫杉烷环的特定位置上。
这种复杂的结构赋予了紫杉醇独特的物理和化学性质。
2. 紫杉醇的抗癌作用机制紫杉醇主要通过促进微管蛋白聚合，抑制微管解聚，从而稳定微管结构来发挥抗癌作用。
在细胞分裂过程中，微管是构成纺锤体的重要成分，紫杉醇稳定微管的作用会导致纺锤体无法正常形成，进而阻断细胞的有丝分裂过程，使癌细胞停止增殖并最终死亡。
此外，紫杉醇还可能通过其他机制影响癌细胞的生物学行为，如调节细胞信号传导通路、诱导细胞凋亡等。
三、真菌发酵法生物合成紫杉醇的研究进展1. 产紫杉醇真菌的筛选与鉴定研究人员从自然界中广泛筛选能够产生紫杉醇的真菌。
通过对不同环境样本（如土壤、植物组织等）进行分离培养，然后利用高效液相色谱（HPLC）等分析方法检测培养物中是否含有紫杉醇。
经过大量的筛选工作，已经发现了一些能够产生紫杉醇的真菌菌株，如紫杉霉属（Taxomyces）、拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）等。
对这些产紫杉醇真菌进行准确的分类鉴定，有助于深入了解它们的生物学特性和代谢途径。
2. 真菌发酵条件的优化为了提高真菌发酵生产紫杉醇的产量，需要对发酵条件进行优化。
一株产紫杉醇内生真菌的分离及其代谢产物的研究
DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.03.008 ·论著·一株产紫杉醇内生真菌的分离及其代谢产物的研究卢陆洋，秦竹，徐金库，李新松【摘要】目的从南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei）中分离产紫杉醇内生真菌，并研究其抗肿瘤细胞活性。
方法采用组织块法从南方红豆杉的树根部、树主干内层、侧枝及针叶分离纯化内生真菌，经液体发酵培养，抽提发酵粗产物，以标准紫杉醇为对照进行薄层层析（TLC）、紫外光谱（UV）、HPLC、质谱（MS）分析。
同时将经上述方法确认后的内生真菌产的紫杉醇作用于人宫颈癌 HeLa 细胞，采用 MTT 法分析其抗肿瘤细胞活性。
结果从南方红豆杉主干韧皮部分离得到 1 株产紫杉醇内生真菌 D62，其紫杉醇产量为 148.95 μg/L。
对菌株 D62 的菌落和菌丝体的形态学分析表明其属于镰刀属（Fusarium sp.）。
将该菌株产紫杉醇作用于 HeLa 细胞，表现出明显的致细胞凋亡作用。
结论南方红豆杉中分离得到的产紫杉醇内生真菌 D62 具有优良的发酵特性。
【关键词】抗肿瘤药，植物；真菌；发酵；红豆杉属 中国医药生物技术, 2010, 5(3):202-207紫杉醇（Paclitaxel，商品名 Taxol）是复杂的二萜类衍生物，最早于 1971 年由 Wani 等[1]从短叶红豆杉（Taxus breviifolia Nutt.）的树皮中分离，具有独特的催化微管蛋白迅速合成微管作用，并可与微管结合，防止微管解聚[2]。
紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌等，尤其对耐常规药物的肿瘤有较好的疗效，被美国肿瘤研究所认为是人类未来 20 年最有效的抗癌药物之一。
目前，紫杉醇主要从红豆杉的树皮中提取。
由于红豆杉生长周期长，资源缺乏，且天然红豆杉在世界范围内数量很少，而树皮中紫杉醇含量仅为干重的 0.01% ~ 0.03%，仅仅从树皮中提取紫杉醇无法满足市场需求，造成了紫杉醇市场价格昂贵的同时，也严重破坏了自然资源[3]。
内生真菌产紫杉醇研究的回顾与展望
Abstract: Taxol with high efficiency, low toxicity and broad-spectrum is one of the most effective natural anti-cancer drugs for the coming 20 years. Recent studies have found that taxol from the fermentation of endophytic fungi of plants has been demonstrated a high potential for efficient production of taxol. Summarize recent research advances in the technique of fermentation producing taxol including biodiversity of taxol-producing endophytic fungi, isolation of the fungi, and the techniques of taxol extraction. The pathways
红豆杉中产紫杉醇及其类似物内生菌的分离与筛选
安徽农学通报2023年05期动植物·微生物·食用菌·中药材红豆杉中产紫杉醇及其类似物内生菌的分离与筛选郑寒琪沈诗媚赵玉知陈营*（烟台大学生命科学学院，山东烟台264005）摘要为了从红豆杉中分离筛选可以产紫杉醇及其类似物的内生菌，本研究以红豆杉为试验材料，对其针叶和枝条通过划线分离法共筛选得到9株内生菌，对所得菌株用不同发酵培养基进行摇瓶发酵培养，发酵液及菌体经乙酸乙酯萃取浓缩后以紫杉醇标准品为对照进行薄层层析（TLC）检测。
试验发现9株内生菌中有4株可以产生紫杉醇及其类似物，其中内生真菌有3株，内生细菌有1株。
通过细菌16S rDNA扩增测序和真菌Its扩增测序分析可知，3株内生真菌初步确定为1株链格孢菌（Alternaria sp.）和2株Paraconiothyrium brasiliense，1株细菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；相同菌株用不同发酵培养基时，样品Rf值不同，表明培养基成分会影响菌体进入次级代谢的时间，并进一步影响前体物质向紫杉醇的转化。
试验结果为后续紫杉醇这一天然中药成分的生物合成及其代谢调控奠定了基础。
关键词红豆杉；内生菌；紫杉醇；生物合成；代谢调控中图分类号Q949.9文献标识号A文章编号1007-7731（2023）05-0027-05紫杉醇（Paclitaxel，商品名Taxol）是一种复杂的含氮二萜类衍生物，于1971年被美国科学家Wani 等[1]从短叶红豆杉（Taxus breviifolia）的树皮中分离出来。
紫杉醇能抑制微管蛋白解聚，有效抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭，且抑制肿瘤生长的机理已被阐明，在临床上被广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗[2-3]。
紫杉醇作为具有抗癌活性的二萜生物碱类化合物，其新颖复杂的化学结构、广泛显著的生物活性、全新独特的作用机制、奇缺的自然中药资源使其成为举世瞩目的抗癌明星和研究重点。
一株产紫杉醇内生真菌的分离及其代谢产物的研究
一株产紫杉醇内生真菌的分离及其代谢产物的研究卢陆洋;秦竹;徐金库;李新松【期刊名称】《中国医药生物技术》【年(卷),期】2010(005)003【摘要】目的从南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)中分离产紫杉醇内生真菌,并研究其抗肿瘤细胞活性.方法采用组织块法从南方红豆杉的树根部、树主干内层、侧枝及针叶分离纯化内生真菌,经液体发酵培养,抽提发酵粗产物,以标准紫杉醇为对照进行薄层层析(TLC)、紫外光谱(UV)、HPLC、质谱(MS)分析.同时将经上述方法确认后的内生真菌产的紫杉醇作用于人宫颈癌HeLa细胞,采用MTT法分析其抗肿瘤细胞活性.结果从南方红豆杉主干韧皮部分离得到1株产紫杉醇内生真菌D62,其紫杉醇产量为148.95μg/L.对菌株D62的菌落和菌丝体的形态学分析表明其属于镰刀属(Fusarium sp.).将该菌株产紫杉醇作用于HeLa细胞,表现出明显的致细胞凋亡作用.结论南方红豆杉中分离得到的产紫杉醇内生真菌D62具有优良的发酵特性.【总页数】6页(P202-207)【作者】卢陆洋;秦竹;徐金库;李新松【作者单位】210018,南京,东南大学化学化工学院生物材料和药物释放实验室;210018,南京,东南大学化学化工学院生物材料和药物释放实验室;210018,南京,东南大学化学化工学院生物材料和药物释放实验室;210018,南京,东南大学化学化工学院生物材料和药物释放实验室【正文语种】中文【相关文献】1.一株产甘草酸内生真菌的分离及代谢产物分析 [J], 王红霞;李雅丽2.一株产紫杉醇内生真菌的分离及鉴定 [J], 梁盛年3.一株产紫杉醇的红豆杉内生真菌的分离鉴定 [J], 张红涛;邓百万;陈文强;刘开辉;丁小维;顾东升;李华4.一株产紫杉醇菌的分离及其代谢产物对HeLa细胞抑制作用的研究 [J], 赵凯;赵立斐;金媛媛;魏海霞;平文祥;周东坡5.一株产紫杉醇的南方红豆杉内生真菌的分离及分类研究 [J], 田仁鹏;杨桥;周国玲;谈静泉;张珞珍;方呈祥因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离鉴定
西北植物学报,2007,27(9):1874-1878Acta Bot.Boreal.-Occident.Sin.文章编号:1000-4025(2007)09-1874-05*南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离鉴定郭晓静1,王俊鹏2,宋晓平1*,周 乐3,豆传娜1(1西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨陵712100;2西北农林科技大学农学院,陕西杨陵712100;3西北农林科技大学理学院,陕西杨陵712100)摘 要:从南方红豆杉(T ax us chinensis v ar.mair ei)植株分离到内生真菌63株,其中24株经鉴定分属于19个种(属).真子囊菌纲的2个属2株,半知菌纲的14个属22株.真子囊菌纲的无毛毛壳属(A chaetomium sp.)的1株为新发现种.半知菌纲的葡萄孢属(Botr y tis sp.)1株和无孢菌群(M y celia s ter lia)2株的培养液,经浓缩萃取,薄层层析检测,Rf值分别为0.404、0.404、0.401,与紫杉醇对照品Rf值一致,为南方红豆杉产紫杉醇内生真菌.关键词:南方红豆杉;紫杉醇;内生真菌;分离;鉴定中图分类号:Q946.8;Q93-331文献标识码:AIsolation and Identification of the Taxo-l producingEndophytic Fungi from Taxus chinensis var.maireiGUO Xiao-jing1,WAN G Jun-peng2,SONG Xiao-ping1*,ZH OU Le3,DOU Chuan-na1 (1College of Animal Science and T echnology,Northw est A&F University,Yan gling,S haanxi712100,C hina;2College of Ag-ronomy,Northw est A&F U niver sity,Yanglin g,S haanx i712100,China;3College of Science,Northw est A&F University,Yan-glin g,Shaanx i712100,Chin a)Abstract:Six ty-three strains of endophy tes w ere isolated and obtained from the stems,leaves and roo ts of Tax us chinensis v ar.mairei,of w hich24strains belonged to19g enera(gro ups)acco rding to their m orpho-logical characterization,respectively.T her e w ere2strains in g enera of A sco mycotina and22strains in14 genera o f Deutermy cotina.1strain in genera of A chaetomium sp.w as a new species.1strain in genera of Deutermy cotina and2strains in g roup of My celia ster lia w ere the tax o-l producing endophy tic fungi,w hich the Rf o n thin lay er chrom ato graphy(TLC)o f the extracts fr om fermentation liquid w er e0.404,0.404,0. 401,respectively,the v alue is close to that of sdanderd tax ol.Key words:Tax us chinensis v ar.mairei;tax ol;endophytic fung i;isolation;identification自从红豆杉中发现具有独特抗癌作用的紫杉醇后,红豆杉曾遭毁灭性砍伐.为了解决紫杉醇的来源和保护红豆杉,人们进行了大量的研究保护工作. 1994年H olton[1]和Nico lao u[2]分别完成了紫杉醇的全合成,但合成路线复杂,反应条件难以控制,试剂繁多,制备成本昂贵,不能进行工业化生产.半合成方法中的前体物质仍然要从红豆杉中提取的[3].采用细胞培养及植物愈伤组织诱导是制备紫杉醇的新途径,但细胞生长慢,紫杉醇含量低,生产费用高,也未达到实用水平[4].1993年Stierle[5]等发现太平洋红豆杉树皮的内生真菌(T ax omy ces andrean-ae),并从发酵液中分离得到了紫杉醇.之后研究者*收稿日期:2007-04-04;修改稿收到日期:2007-07-05基金项目:国家自然科学基金(30571402)作者简介:郭晓静(1972-),女,硕士研究生,主要从事中药化学成分及药理作用研究.*通讯作者:宋晓平,博士,教授.E-mail:sxpxbn l@发现了更多能产生紫杉醇的内生真菌[6],但产量均不高.近年来,利用基因组学、蛋白组学和代谢组学,有目的地、精确地改造微生物菌株等,获得了高产紫杉醇的工程菌株.赵凯[7]等通过理化方法,对NCEU-1菌株进行处理并使紫杉醇产率提高到100 g/L.因此,利用内生真菌生产紫杉醇,可能是解决紫杉醇药源紧缺的理想途径.本研究对南方红豆杉(Tax us chinensis var.mair ei)的内生真菌进行分离纯化、分类及产紫杉醇菌株鉴定,旨在为进一步开发利用提供基础资料.1 材料和方法1.1 材料和仪器1.1.1 试验材料 人工种植的4年生南方红豆杉(购自陕西杨凌中科环境工程公司);紫杉醇标品(购自中国药品生物制品检定所).1.1.2 主要器械 LRH-50-SI智能型人工气候箱(广东省医疗器械厂);SW-CJ-1F洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);YX-280B手提式不锈钢蒸汽消毒器(上海三申医疗器械有限公司);101A型电热鼓风干燥箱(上海实验仪器有限公司);薄层色谱层析缸(上海信谊仪器厂制造);RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);光学显微镜(重庆麦克光电仪器有限公司)等.1.2 内生真菌的分离采集南方红豆杉的根、茎、叶,洗净,切成小段,在超净工作台内无菌水冲洗5m in,70%酒精漂洗20s,无菌水冲洗3次.用无菌刀剥除根和茎的外皮,留取内皮和韧皮部,叶剪去外缘,切成0.5cm 0.5cm的小片,植于M artin固体培养基上,在25 智能型人工气候箱内培养,发现有菌丝生长时,挑取菌丝的顶部,纯化2~3次,置4 冰箱备用.1.3 内生真菌的分类鉴定根据真菌在M ar tin培养基上生长情况,采用直接挑取制片法或插片培养法,显微镜观测培养过程中的菌丝、产孢结构、分生孢子梗着生情况、孢子形态与颜色等特征参考文献[8~10]进行鉴定.菌种于4 冰箱保藏,每4个月复壮1次.1.4 产紫杉醇菌株的筛选1.4.1 内生真菌培养物的制备 分离菌接种于M artin液体培养基[11],每24h振荡1次,25 下培养16~18d,超声波清洗仪400H z处理20min,真空抽滤,滤液于60 旋转蒸发至原体积的1/10,加等体积乙酸乙酯萃取5h,收集乙酸乙酯萃取液,再重复用乙酸乙酯萃取4次,合并乙酸乙酯萃取液,旋转蒸发至干,加适量甲醇溶解,用于紫杉醇的定性检测.1.4.2 紫杉醇的定性检测[12] 胶G薄板于105 活化40min,趁微热时点样,展开剂为二氯甲烷 甲醇(20 1),预饱和30min,上行法展开(室温24 ),1%香草醛的浓硫酸液于105 加热8min 显色,与紫杉醇对照品比较,计并算显色斑的Rf值,筛选产紫杉醇的菌株.2 结果与分析2.1 内生真菌的分离及鉴定从南方红豆杉中共分离到内生真菌63株,其中24株经鉴定分属于19个种(属).真子囊菌纲的无毛毛壳属和毛壳菌属各1株.半知菌纲的12个种(属)22株:枝孢霉属3株,头孢霉属、青霉属、单端孢属、曲霉属、镰刀属、单链孢属各2株,链格孢属、大茎点霉属、灰葡萄孢菌属、拟青霉属各1株,未产生孢子的3株,归为无孢类群.隶属半知菌纲的菌株占91.67%,是绝对优势株.此外,通过对子囊果结构、子囊壁的膜质结构、子囊的颜色、孔口以及子表1 南方红豆杉内生真菌的培养特性及产紫杉醇情况T able1 T ax ol pr oduction,culture character istics and mor pholog y o f endophyticfung us fr om T ax us chinensis v ar.mair ei菌株编号Co de o f strain种(属)Species(Genus)培养特性与形态特点Characteristic o f cultivat i o nand f ormat i o n紫杉醇检测Det eminationo f tax ol10无毛毛壳菌属A chaet omium sp.白色菌丝渐转为淡褐色,絮状,生长迅速,基质为褐色.子囊果表生,球形,壁褐色,有孔口,子囊壁为膜质,果壁细胞褐色,多边形不规则,子囊无毛,子囊孢子成熟后橄榄色或浅褐色,呈柠檬形.无蓝色斑点No blue spot14灰葡萄孢菌Botry tis ci nerea白色絮状菌丝,生长迅速,低温下仍生长,培养时间长时有褐色硬质菌核生成,基质无色.分生孢子梗长,灰色,分枝,顶部细胞扩大成圆形,在短梗上有分生孢子簇.蓝色斑点Blue spot,Rf=0.40416无孢菌群My celia sterli a白色絮状菌丝生长迅速,3~5d能长满直径为9cm培养皿,有褐色菌核生成,质硬,基质无色.没有孢子产生.蓝色斑点Blue spot,Rf=0.40419无孢菌群My celia sterli a白色絮状菌丝,基质无色.没有孢子产生.蓝色斑点Blue spot,Rf=0.40418759期 郭晓静,等:南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离鉴定囊孢子的数目、形状、大小和芽孔等特征鉴定,发现10号菌与真子囊菌纲的无毛毛壳菌属(A chaetom i -um sp.)已记录的3个种的特征不完全相同,为一新发现种.10号、14号、16号、19号菌株的培养特性及形态特点见表1及图1~4.2.2 内生真菌产紫杉醇的检测内生真菌中的灰葡萄孢菌1株和无孢菌群2株的培养液,经浓缩萃取,薄层层析检测,Rf 值分别为0.404、0.404、0.401,与紫杉醇对照品Rf 值一致,为南方红豆杉产紫杉醇内生真菌(表1).图1 10号菌株的菌落生长状况(无毛毛壳菌属)图2 14号菌株的菌落生长状况(葡萄孢属)白色菌丝渐转为淡褐色,絮状,生长迅速,白色絮状菌丝,有褐色硬质菌核生成,基质为褐色.(A.正面;B.反面)基质无色.(A.正面;B.反面)Fig.1 Septat e m ycelium of number 10(A chaetomium sp.)Fig.2 Septat e my celium of number 14(Botr y tis sp.)H ypha is w ooly,w hite,gradually turning pale T he w ooly and w hite hyph a grow s rapidly.If it has b een culturedbrow n.(A.Obvers e;B.Inver se)for a long time ,it will produce br ow n sclerotium w hich has a h ard texture.Its substratum is hyaline.(A.Obverse;B.Inverse)图3 16号菌株的菌落生长状况(无孢菌群)图4 19号菌株的菌落生长状况(无孢菌群)白色絮状菌丝生长迅速,3~5d 能长满9cm 培养皿.(A.正面;B.反面)白色絮状菌丝,基质无色.(A.正面;B.反面)F ig.3 Septate mycelium o f number 16(My celia ster lia )F ig.4 Septate mycelium of number 19(M y celia ster lia )T he w ooly an d w hite hy pha grow s rapidly,its colony T he w ooly an d w hite hy pha grow s rapidly,attains 9cm diam eter in 3~4d.(A.Obverse;B.Inverse)its sub stratum is hyaline(A.Obvers e;B.Invers e)3 讨 论3.1 内生真菌的分离纯化内生真菌(endo phytic fungi)的生命过程全部或部分阶段生活在健康植物中,19世纪末首先从黑麦种子中发现了内生真菌,但当时未引起足够的重视.20世纪30年代,人们发现感染内生真菌的牧草可引起家畜中毒,此后内生真菌的研究才得以广泛开展[13].目前,内生真菌的分离纯化主要有标准法和平板灌注法[14,15].标准法是将植物组织表面消毒,去除外皮层将内部组织削成片状,置入培养基中,待菌丝长成后,挑取菌丝末端培养纯化;平板灌注法则需要同时除去外皮层和木质部,并研成匀浆注入融化的培养基中培养.本试验采用标准法对南方红豆杉中的内生真菌进行了分离纯化,共分离到内生真菌63株,其中24株经鉴定分属于19个种(属).由于内生真菌在木质部也有寄生,且多为稳定的内生真菌,因此标准法不仅操作简单,而且分离到的内生真菌更加全面而多样.3.2 南方红豆杉内生真菌的分类鉴定内生真菌多属于半知菌纲(Deutero mycotina),只以分生孢子进行繁殖,有性阶段尚未发现,且少数1876西 北 植 物 学 报 27卷只有菌丝,而不能形成孢子[16].因此,内生真菌的鉴定较困难,不仅需要丰富的经验,还需要相当长的时间.由于时间和经验的原因本试验对分离到的63株中的内生真菌进行鉴定的仅有24株,还有相当一部分菌株没有鉴定到具体的属,但通过显微观察及结合相关的形态观察我们认为这63株内生真菌分属于不同的39种(属).近年来,我国对东北红豆杉的内生真菌的研究相对较多[8,16-18],也积累了一定的分类鉴定资料,而南方红豆杉内生真菌的分类鉴定仅见数篇报道[19].本试验从南方红豆杉中分离到的半知菌纲菌株占91.67%,是绝对优势株,这与文献[20]报道一致.3.3 产紫杉醇的内生真菌在长期的共生环境中,内生真菌和宿主植物相互作用,建立了平衡关系,在植物体内形成相对稳定的真菌菌群,为此很有可能获得了相关基因的直接传递,能产生与宿主相同的成分[19].自20世纪70年代在红豆杉中发现产紫杉醇的内生真菌以来[3],产紫杉醇的内生真菌的研究已成为热点课题.到2006年为止,共发现产生紫杉醇的内生真菌共25属36株[6,19].本试验鉴定的24株南方红豆杉内生真菌中,经T LC 定性检测,发现3株南方红豆杉内生真菌能产生紫杉醇,其中14号菌为灰葡萄孢菌,与胡凯等[19]发现的产紫杉醇的XT2为同一属,但不是一个种;另外2种为无孢菌群,王伟等[21](1999)在南方红豆杉中也分离出1株无孢菌株产紫杉醇,但对其培养特性及特点未作报道.迄今为止,发现的产紫杉醇的内生真菌有36株,但产量均不高,只有工程菌株T PF -1的产量为448.520 g/L [6].对南方红豆杉的内生真菌仅胡凯等[19]对产紫杉醇的能力有报道,其中XT 2菌株的产紫杉醇能力为161.24 g/L,XT 5菌株的产紫杉醇能力为276.75 g/L,XT17菌株的产紫杉醇能力为10.25 g/L.本试验通过T LC 的初步检测,根据斑点的大小,3株菌株的产紫杉醇量由高到低依次为:16号菌、19号菌、14号菌.对它们产量的定量分析,以及菌种的诱变等工作,目前正在进行之中.致谢:内生真菌的鉴定得到西北农林科技大学植物保护学院朱明旗博士和郭云忠博士的支持和帮助,特此致谢.参考文献:[1] H OLTON R A,SOM OZA C,KIM H B,LIANG F,BIE DIGER R ,BOATM AN P D,SH INDO M ,SM IT H C C,KIM S C,NADIZADEHH ,S UZU KI Y,T AO C L,VU P,T ANG SH ,Zh ANG P S ,M URTH I K K,GENTILE L N,LIU J H ,Firs t total synth esis of taxol 1:func -tionalization of the B ring[J ].A m.Chem.S oc.,1994,116:1597-1598.[2] NICOLAOU K C,YANG Z,LIU J J,U ENO H ,NNTERM ET P G,GY R K,CL AIBOM E C F,RENAUD J B,COULADOURUS E A,PUU LVANNAN K,S ORENSE N E J.T otal synthesis of taxol[J].Nature (London),1994,367:630-634.[3] S TROBE L G,ST IERLE A,S TIERLE D,HE SS W M.T ax omyces 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948"基金6项,国家科技攻关项目基金38项,国家博士点基金18项,国家实验室基金10项.2.中国科学院基金38项,占基金项目总数的5.1%,其中:百人计划基金6项,知识创新工程基金14项,西部之光基金8项,其它基金(含院长基金)10项.3.各部委基金78项,占基金项目总数的10.5%,其中:教育部基金33项,科技部基金7项,农业部基金2,其它部委基金36项.4.中外合作基金7项,占基金项目总数的0.9%.5.大学基金80项,占基金项目总数的10.7%.6.省、市各类研究基金224项,占基金项目总数的30.1%.(南红梅 供稿)。
一株紫杉醇内生真菌的分离和鉴定
实验：一株紫杉醇内生真菌的分离与鉴定不同的表面消毒方法和不同的培养基使得红豆杉内分离出来的内生真菌有其多样性，另外，由于红豆杉品种的不同，也可能使得实验结果出现一定的差异性．以下结合了中国红豆杉、南方红豆杉以及三尖杉的处理方法，来探讨从红豆杉内分离纯化内生真菌的方案，从而应用于实验室具体操作和取得最佳结果．如：采用化学法进行表面灭菌处理,运用平板涂布法及平板划线法得到内生真菌，然后利用分子鉴定法来鉴定菌种。
一．材料及试剂１.１材料：百年红豆杉的树皮样品，某年某月采于_______１.２试剂：无菌水，蒸馏水，７５％乙醇溶液，０.１％升汞溶液,马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15-20g,蒸馏水100ml,lmol/LNaOH或lmol/LHCL溶液0.1g/l氯霉素或土霉素，0.05%吕氏碱性美蓝染色液,乙酸乙酯-丙酮，二甲醇，三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇，浓硫酸，香草醛，紫杉醇标准品, １.３仪器设备：无菌容器，培养皿，高温蒸汽灭菌锅，无菌剪刀或手术刀，无菌滤纸，细毛刷，恒温箱，电子分析天平，玻璃棒，纱布，试管或者锥形瓶，pH试纸，恒温箱，研钵，移液管，平板，接种环，超净台，酒精灯，胶头滴管，盖玻片，载玻片，镊子，光学显微镜，三角瓶，抽滤器，蒸发皿，分液漏斗，UF254硅胶板，电热鼓风干燥箱，喷壶，铅笔，直尺，毛细管，薄层板，层析缸，电吹风，酒精灯，镊子，紫外光灯，磨砂纸二．实验操作２.１内生真菌的分离２.１.1方法一：将树皮在洗衣溶液中浸泡３０min,并用细毛刷刷去表面污垢，然后在自然水中冲洗２０min.冲洗完成后转移至超净工作台上，用无菌滤纸吸干，放入７５％的乙醇中消毒３０s,然后用无菌水漂洗３次，再放入０.１％的升汞溶液中浸泡8min，取出后用无菌水漂洗４次．最后，用手术刀将树皮剪成０.５＊０.５cm小块，再放入事先准备好的PDA固体培养基平板中，２８℃恒温培养３－５d．每天观察一次，确定菌丝生长时间．等长出菌丝后，挑取平板中单一菌落进一步纯化，纯化后的菌株转接到装有PDA斜面培养基上，２８℃下恒温保存．当菌落长满斜面后，划线接种于平板培养基上，每２d观察一次，根据菌落的形状颜色以及长出时间的不同，有不纯的菌落就要继续划线分离培养，直到得到纯种．将纯化后的菌株编号记下，接入PDA斜面培养基，于２８℃恒温培养６－７d后，保存于４℃冰箱。
产紫杉醇内生真菌06081的分离及鉴定
关键词院红豆杉渊栽葬曾怎泽 曾 皂藻凿蚤葬冤曰紫杉醇曰内生真菌曰员愿 杂 则阅晕粤曰毛霉渊酝怎糟燥则 泽责援冤
中图分类号院杂源缘怨
文献标识码院粤
文章编号院0439原愿114渊圆园12冤23原5315-03
陨泽燥造葬贼蚤燥灶 葬灶凿 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 粤 栽葬曾燥造原责则燥凿怎糟蚤灶早 耘灶凿燥责澡赠贼蚤糟 云怎灶早怎泽 韵远园月员
园苗圃遥 真菌分离及培养用培养基为 孕阅粤 培养基 渊孕燥贼葬贼燥 凿藻曾贼则燥泽藻 葬早葬则冤 和 孕阅蕴渊孕燥贼葬贼燥 凿藻曾贼则燥泽藻 造蚤择鄄 怎蚤凿冤培养基袁发酵培养基为 再耘杂 培养基咱苑暂遥 紫杉醇标 样购自 杂蚤早皂葬 公司曰其他试剂均为国产分析纯遥 员援圆 试验方法 员援圆援员 内生真菌的分离与纯化 内生真菌的分离 和纯化参照已报道的方法咱苑袁愿暂袁经纯化后的内生真菌 接种于 孕阅粤 斜面保存于 源 益冰箱遥 员援圆援圆 紫杉醇的提取及 匀孕蕴悦原酝杂 分析 内生真菌 紫杉醇的提取及高效液相色谱法渊匀蚤早澡 责藻则枣燥则皂葬灶糟藻
第 51 卷第 23 期 圆园1第2 年23 1期2 月
湖北农业科学 匀ubei 粤gricultural 杂ciences
灾燥造援 51 No.23 Dec援袁圆园12
产紫杉醇内徐 曼 圆袁敖明章 圆袁付春华 圆袁余龙江 圆袁顾玉成 员
渊员援湖北省农业科学院经济作物研究所袁武汉 源猿园园远源曰 圆援华中科技大学生命科学与技术学院资源生物与生物技术研究所袁武汉 源猿园园苑源冤
通讯作者袁余龙江渊员怨远远原冤袁男袁教授袁研究方向为生物技术曰渊电话冤园圆苑原愿苑苑怨圆圆远源渊电子信箱冤赠怎造燥灶早躁蚤葬灶早岳皂葬蚤造援澡怎泽贼援藻凿怎援糟灶曰 顾玉成渊员怨缘苑原冤袁研究员袁研究方向为植物生物技术袁渊电话冤园圆苑原愿苑猿愿园怨圆远渊电子信箱冤早赠糟澡员员怨岳赠葬澡燥燥援糟燥皂援糟灶遥
南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离
用摇瓶发酵培养 的方法筛选 产紫 杉醇 的内生真 菌。发酵物和菌丝体经研磨 、 离心 、 乙酸乙酯萃取 和浓缩 ， 经硅胶薄
层层析（ Ｌ ）高效 液相色谱 （ Ｌ ）Ｌ Ｔ Ｃ， ＨＰ Ｃ Ｉ及液相色谱一 ） ． 质谱（ Ｌ — ） ＨＰ Ｃ ＭＳ分析和检测 ， 结果 表 明， 茎部分 离的 １株 内生 从 真菌能够 产紫杉醇或其 异构体， 产量达 １０ｉ －。通过对产紫杉醇 内生真菌进行诱变 、 ８ ｇＬ ｘ 筛选 以及优化培养条件等 措施 ， 大规模培养生产紫杉醇是具有可行性 的。 关键词 ： 南方红豆杉 ；内生菌 ； 紫杉醇
ｓ ａ ｙ ｍｕ ａ ｅ ｅ ｉ， ｃ ｅ ｎ ｇ ａ ｄ ｏ ｔ ｚ ｇ ｔ ｅ ｃ ｌ ｒ ｏ ｄ ｔ ｎ ｃ ｌ ｂ ｔｇｎ ｓ ｓｒｅ ｉ ｐ ｉ ｉ ｕｔ ｅｃ ｎ ｉ ｏ ． ｅ ｓ ｎ ｎ ｍｉ ｎ ｈ ｕ ｉ
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产紫杉醇内生真菌O60B1的分离及鉴定
产紫杉醇内生真菌O60B1的分离及鉴定摘要：从曼地亚红豆杉（Taxus x media）树皮内表皮中分离得到1株产紫杉醇的内生真菌O60B1，并通过高效液相色谱法（HPLC）和质谱法（MS）分析其发酵产物，其紫杉醇产量为2.5～3.0 μg/g（紫杉醇/菌丝干重），并通过形态学特征和18 S rDNA序列分析，将其初步鉴定为毛霉属（Mucor sp.）真菌。
关键词：红豆杉（Taxus x media）；紫杉醇；内生真菌；18 S rDNA；毛霉（Mucor sp.）Isolation and Identification of A Taxol-producing Endophytic Fungus O60B1Abstract：A taxol-producing endophytic fungus O60B1 was isolated from the inner bark of Taxus x media. It could produce 2.5～3.0 μg taxol per one gram dry weight of mycelium according to determination of high performance liquid chromatography（HPLC）and mass spectrometry（MS）. The fungus O60B1 was defined as Mucor sp. through morphological observation and 18 S rDNA sequence analysis.Key words：Taxus x media；taxol；endophytic fungi；18 S rDNA；Mucor紫杉醇是最先分离自红豆杉的高效抗肿瘤药物[1，2]。
但由于红豆杉资源稀缺，直接从红豆杉植物中提取紫杉醇无法满足市场需求，利用微生物发酵法生产紫杉醇是解决紫杉醇药源紧缺问题的有效途径之一[3-6]。
产紫杉醇内生真菌的筛选研究
作者简介 ： 陈建华 ， ， 男 副研究员 ， 现从事生物技术与生物制药研究
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２０ ０２年 ２ 第 ５期 ４卷
中 国麻 业
Ｐ ＡＮ ＩＥ Ｎ Ｒ Ｄ Ｃ Ｓ Ｌ ＴＦＢ ＲＡ Ｄ Ｐ Ｏ Ｕ Ｔ
１材料 与方 法
１ １材 料 ．
１１ １ ． ． 标本采集 ： 从湖南 、 四川、 云南等地采集云南红豆杉培养基
女人事部 留学归国人员择优资助活动项 目［ ，ｋ２０ ）０ 】湖南省科技厅项 目（１ Ｙ ２０ ） ￣ ）． ０ １ｌ 号 ； （ ０Ｊ ００ ２ Ｚ
天左 右 。
关键词 ： 紫杉醇 内生真茵 薄层层析 紫外分析
紫 杉醇 的 国 际通 用 名 为 Ｐ ｅｔｘｌ， 品 名为 Ｔｘｌ， ａｌａｅ 商 ｉ ａｏ 是二 十 世纪 ６ ０年 代后 期 美 国科 学 家从太 平 洋紫 杉 （ 野性 的太 平洋 紫杉 树 ） 即红 豆杉 树 皮 中提取 的一种 二 萜类 生 物碱 。直 到 ８ ０年 代初 才发 现 其具 有抗 肿瘤 作用 ， 别 是对 卵巢 癌 、 腺 癌 、 癌 、 道 癌 、 列 腺癌 、 特 乳 肺 食 前 以及直 肠癌 等有 特效 ， 此 外， 在风 湿性 关 节炎 、 中风 、 老 性痴 呆 等 的治疗 上 ， 有 良好 的前 景 ， 早 也 被誉 为近 十几 年来 天 然 药物 研 究领 域最 重 大 的发 现 ， 因此受 到 世界 各 国 的重视 。由于生 产 紫杉 醇 的原 材料 （ 豆杉 树 皮 ） 红 紧缺 ， 在 尝试 了诸 如化 学半 合 成 和全合 成 法 、 织 培养 法 生 产紫 杉 醇等 方法 后 ，自 ９ 组 ０年代初 始 ， 多 国 许 家 ， 别 是发达 国家 ， 继 开展 了筛 选 产紫 杉 醇微 生 物 的开拓 性研 究 。如 ： 国蒙 大拿 州 立大 学教 特 相 美 授 Ｇ ｒ ．Ｓｒｂｌ ａ Ａ ｔ ｅ 等于 １９ ｙ ｏ ９ ３年从 短 叶红 豆杉 （ ．ｒｖｏｉ 中分 离筛 选 出一 株产 紫杉 醇 内生 真 菌 Ｔ ｂｅｉｌ ｆ ａ） （Ｔｘｍｙｅ ｎｒａａ ，产 率 为 ２ ５ ｖ ／［ ａｏ ｅｓａｄｅｎｅ） ４～ ０ ｇ １ 引 ，１９ ９ ６年 ，他们 又从喜 马拉 雅 山红 豆 杉 （Ｔ ．
产紫杉醇真菌NK-101关键基因的功能研究与营养缺陷型菌株的构建的开题报告
产紫杉醇真菌NK-101关键基因的功能研究与营养缺陷型菌株的构建的开题报告一、研究背景紫杉醇是一种广泛用于抗癌的有效化合物，尤其在治疗卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌方面具有明显的临床疗效。
大多数紫杉醇是通过野生的太平洋紫杉树种提取而来，但是这种方法存在着资源枯竭和费时费力等问题。
因此，开发高效能产紫杉醇的微生物是一条重要的研究方向。
目前，已从分离的植物内生真菌中发现了一种全新的能产紫杉醇的菌株——真菌NK-101，该菌株是一株内生真菌，具有非常高的紫杉醇合成能力。
然而，由于其基因组序列的限制，目前对该菌株的紫杉醇合成途径及产生的关键中间体的合成酶仍未完全确定，因此对该菌株的基因检测和深入研究很有必要。
二、研究目的本研究的目的是探索真菌NK-101产生紫杉醇的机制，并通过构建一系列营养缺陷型菌株，进一步鉴定NK-101产生紫杉醇过程中的营养物。
具体研究内容包括：1. 筛选NK-101关键基因，包括紫杉醇合成途径中的关键中间体的合成酶。
2. 构建一系列营养缺陷型菌株，并通过基因修饰、转化等技术进行确认。
3. 分析不同菌株之间产生紫杉醇的量和营养物对产量的影响，从而确定产生紫杉醇过程中的关键营养物。
三、研究方法1.菌株的筛选和培养使用太平洋紫杉树中分离到的一株真菌NK-101，进行菌株的筛选和培养。
2.提取和定量分析紫杉醇通过高效液相色谱法（HPLC）或者质谱法对NK-101的发酵产物进行提取和定量分析，确定其紫杉醇和中间体的含量。
3.分离和基因检测通过PCR技术，分离出NK-101的DNA，对含有紫杉醇合成途径或相关途径的基因进行检测和分析。
4.构建营养缺陷型菌株通过基因修饰技术，针对NK-101中与紫杉醇合成相关的基因，设计和构建一系列营养缺陷型菌株。
5.分析关键营养物通过比较不同菌株的紫杉醇产量和发酵的营养物组成，确定对NK-101的产生紫杉醇过程中关键的营养物，例如某种氨基酸。
四、研究意义本研究一方面将深入挖掘NK-101发酵产生紫杉醇的机制，有助于解析紫杉醇在NK-101中的合成途径和产生的关键中间体。
一株产紫杉醇内生真菌的分离及鉴定
１２１ 茼株 分 离方 法 ．．
取三龄 树 的 中国南 方 红豆 杉 的根 、 、 片 ， 用 自来 水洗 净 ； 茎 的 树皮 剥 下后 切 成 １ 茎 叶 先 将 ．ｃ ０ ｍｘ
收 稿 日期 ：０ ９ ０ －１ ２０— ６ ５ 作者 简介 ： 渠盛年 （ ９ ３ ， 广 东肇 庆人 。 庆 学 院生命科 学学院 实验 师 １ ７ 一）男， 肇
１０ ０ ｍＬ， １ １ 的温 度 下 灭 菌 ２ ｍｉ ． 在 ２℃ ０ ｎ
３萃取液 ： ） 乙酸 乙酯一 丙酮 （ 体积 比１１ ． ：） ４紫 杉 醇 标 准 样 ： 自Ｓｇ 公 司 ． ） 购 ｉｍａ ５ｒ Ｃ色 谱 仪 ： ａ ｒ ０ 高 效 液 相 色 谱 仪 ， ａ ｒ２ ８ 检 测 器 ， ｌｎｕ 色 谱 管 理 系 统 （ 国 ）ｍＬ Ｗ ｔ ｓ ６０ ｅＴ Ｍ Ｗ ｔｓ４７ ｅ Ｍｉｅｉｍ￣ ｌ 美
摘 要 ： 中 国 南 方 红 豆 杉 三 龄 树 树 皮 中 分 离得 到 内 生 真 茵 Ｚ ７， 液 体 发 酵 ， 高 效 液 相 色谱 技 术 对 该 从 Ｕ０ 经 用
真 菌 的 发 酵 液 提 取 物 进 行 了分 析 ， 果袁 明 菌 株 Ｚ ７ 合 成 抗 癌 药 物 紫 杉 醇 ， 紫 杉 醇 含 量 约 为 ２４４ ｇ Ｌ 结 Ｕ０ 能 其 １ ．５ｐ ／ ． ，
关 键 词 ： 国 南 方 红 豆 杉 ；紫 杉 醇 ： 内 生 真 茼； 高 效 液 相 色谱 法 中 中 圈 分 类 号 ：４ ９ Ｓ ５ 文 献标 志码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ９ ８ ４ （０ １ ０ — ０ １ ０ １０ —４ ５ ２ １ ）２ ０ ６ — ３
紫 杉 醇 （ ａｌａｅ， 品 名 为 Ｔ ｘ １是 迄 今 为 止 发 现 的 最 有 效 的 抗 癌 药 物 之 一 ． 床 试 验 结 果 表 明 ， Ｐｃｔ ｌ商 ｉｘ ａｏ） 临
中国红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分离与鉴定
中 国红 豆 杉 中产 紫 杉 醇 内生 真 菌 的分 离 与 鉴定
殷 东林 ， 孙 伟， 王 锐 丽
途径 。利用 微生 物发 酵生 产紫杉 醇具 有 内生 真菌 生 长迅速 、 易 于培 养 、 可 以在发酵 罐 中进行 工业 化 生产 ， 且 所用 的培 养 基 成本 较 低 等 诸 多 优点 。因
溶液、 葡萄糖 、 ７ ５ 酒精、 乙 酸 乙酯 、 丙 酮、 甲醇 、
ＧＦ ２ ５ ４型 硅 胶 、 三氯 甲 烷 、 乙腈 、 浓硫酸 、 香 草 醛 和 紫杉 醇标 准 品 Ｊ ￥ ９ ０ １ ７ ７ — ２ ０ ｍｇ （ 纯 度为 ９ ８ ） 。
ｃ ｅ ｓ ａ ｎ ｄ ｒ ｅ ａ ｎ ａ ｅ ） ， 提 供 了 一 个 可 能 生 产 紫 杉 醇 的 新
转蒸 发 仪 （ 上 海亚荣 生化仪器 厂） 、 Ｋ ＤＣ 一 １ ４ ０ ＨＲ
型高 速冷 冻离 心机 （ 安 徽 中科 中 佳 科 学 仪 器 有 限
公 司） 、 Ｊ Ｙ９ ２ 一 ｌ Ｉ 型 超声 波细 胞粉 碎机 （ 宁 波新芝 生
物科 技股 份 有 限公 司 ） 、 层析缸 、 Ｓ ＨＢ — Ｂ ９ ５ Ａ 型 循
环水 式真 空泵 （ 郑州长城科ｌ Ｔ贸 有 限公 司 ） 、 布 氏 漏 斗 和 ＵＢ １ ０ ０ ｉ 型显微镜 （ 重 庆 奥 浦 光 电 技 术 有
限公 司 ） 。
１ ． １ ． ３ 试剂
Ｐ Ｄ Ａ 培养 基 、 无菌水 、 ０ ． １ 升 汞
产紫杉醇_Taxol_内生真菌的生物多样性
菌物研究2003,1(1):28-32Journal of Fungal Research V ol 11,N o 11,2003ISS N 1672-3538产紫杉醇(Taxol )内生真菌的生物多样性①马玉超1,赵 凯2,王世伟1,张 建1,齐晓辉1,周东坡1,2②1.齐齐哈尔大学生命科学与工程学院,黑龙江齐齐哈尔1610062.黑龙江大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150080摘 要:主要阐述了产紫杉醇内生真菌的分离和生物多样性的研究状况,紫杉醇产生菌的生物多样性意义及微生物发酵法生产紫杉醇的研究进展,并结合内生真菌的特点,阐述了紫杉醇产生菌的宿主、生境和生态以及物种的生物多样性。
关键词:紫杉醇;内生真菌;生物多样性中图分类号:Q949132 文献标识码:A 文章编号:167223538(2003)0120028205 癌症是严重影响人类健康的重大疾病之一,是仅次于心脏病的第二大死因[1]。
美国国家癌症协会(NIC )预测,在今后的10～15年内,紫杉醇将成为主要的抗癌药物[2]。
紫杉醇作为临床新药,最初是由美国的化学家Wani [3]于1971年从美国西部大森林中称为太平洋紫杉(T 1brevifolia )的树皮中提取出来的。
1979年美国癌症中心(National Cancer Institute )证实紫杉醇有独特的抗癌机理[4],1983年开始进入临床试验。
1992年美国食品和药物管理局(FDA )批准紫杉醇作为治疗转移性卵巢癌的新药上市,1994年又批准该药用于治疗转移性乳腺癌。
目前用于肺癌、结肠癌、支气管癌等的临床试验也有望成功[5]。
但是,制备一例病人所需药物要用3～4棵百年的老紫杉树,而从大约2000棵稀有的紫杉树皮中只能提取1kg 紫杉醇,并且美国环境保护者正试图将此树列入濒危树种。
因此说,紫杉醇的大量临床应用必将靠生物工程,尤其是微生物发酵。
发酵工程能为具有巨大潜在价值的新物种创造良好的生长、繁殖条件,并能进行大规模的培养,充分发挥其内在潜力。
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1999年2月第29卷第1期 西北大学学报(自然科学版)Jou rnal of N o rthw est U n iversity (N atu ral Science Editi on ) Feb .1999V o l .29N o.1 0收稿日期:1998205220 资金来源:陕西省自然科学基金资助项目(FH 95401) 作者简介:马天有(19682),男,硕士从植物分离产紫杉醇的内生真菌的研究0马天有 董兆麟(西北大学生物学系,西安,710069)摘 要 将生于秦岭地区的中国红豆杉树皮中分离得到的一株内生真菌,在马铃薯培养基中进行发酵试验,用薄层层析、薄层扫描检测。
分析结果表明这株真菌能合成紫杉醇,高效液相色谱技术测定其紫杉醇含量约为14120Λg L 。
关键词 中国红豆杉;内生真菌;紫杉醇;薄层层析;高效液相色谱分类号 Q 93915 文献标识码 A 论文编号 10002274 (1999)0120047249 紫杉醇(taxo l )是人类70年代初从短叶红豆杉(tax us bren if olia nu tt )[1]树皮中分离提取到的一种二萜衍生物。
后经Ho rw itz 等研究证实紫杉醇具有独特的抗癌作用机理,它能使癌细胞内纺锤丝的形成受到抑制,有丝分裂不能正常进行,而阻止了癌细胞的扩散。
故1992年被美国FAD 批准用于卵巢癌的治疗。
后又经多年的研究和临床实验,使紫杉醇的抗癌范围逐渐在扩大,目前进行的乳腺癌、肺癌的临床试验已取得很好的效果。
目前紫杉醇主要是从红豆杉树皮中提取的。
由于红豆杉属于濒危珍稀植物,资源有限,生长又很慢,大量砍伐不但危及到自然界的生态平衡,而且也会带来紫杉醇原料的枯竭。
因此,寻找紫杉醇未来新的生产途径,已成为摆在人类面前的一项重大研究课题。
近年来国内外学者主要从3个领域进行探索,即化学合成法、植物细胞培养法[2]和微生物工程法[3]。
目前人们普遍认为微生物工程法是一种最具潜在能力,最具可能性的一种方法[4]。
本文正是采用微生物工程技术,研究从我国秦岭地区生长的红豆杉树皮中,分离产紫杉醇的内生真菌的方法和结果。
1 材料和方法111 材料来源中国红豆杉(tax us chnesis )来源于陕西省留坝县庙台子地区为几十年生的老树。
紫杉醇标准品购自Sigm a 公司。
112 实验用培养基固体培养基:马铃薯200g ,葡萄糖20g ,琼脂20g ,水1000mL ,pH 自然。
配制方法是马铃薯去皮切碎,水煮40m in ,4层纱布过滤,溶入葡萄糖及琼脂后加水定容。
1105kg c m 2灭菌20m in 。
液体培养基:配制方法同上,只是不加入琼脂,分装至250mL 三角瓶中,每瓶50mL 。
1105kg c m 2灭菌20m in 备用。
113 内生真菌的分离和纯化取新采的红豆杉树皮,除去外层老化部分,切成1c m ×1c m 的小块,置于75%的酒精中消毒5m in ,用无菌水冲洗后置于马铃薯固体平板培养基上,25℃培养一段时间后周围长出少量菌丝。
用接种针挑取不同部位的边缘菌丝,分别接种到固体平板上培养,长出新的菌落后,再挑取其尖端菌丝培养,如此反复纯化多次后即可得到一个纯菌株。
114 真菌培养物的预处理及样品溶液的制备用马铃薯液体培养基,250mL 三角瓶中装50mL 培养液,接少量菌丝,30℃,220r m in ,培养6～7d 。
培养物冷冻后用组织捣碎机匀浆3m in (转速为10000r m in ),4层纱布过滤,滤液中加入等体积的氯仿和甲醇混合液(CHC l 32M eO H 10∶1),充分振荡后静置8～12h ,收集有机溶液相,并在45℃条件下减压蒸发,残留物溶于1mL 甲醇中作为样品溶液备用。
115 薄层层析及薄层扫描对真菌培养物紫杉醇的 检测 制备薄层板的硅胶G 购自青岛海洋化工厂,选用的3种展开剂为二氯甲烷2甲醇(95∶5V V );乙酸乙脂2异丙醇(94∶6V V );氯仿2乙腈(9∶1V V )[3]。
显色剂为5%的香草醛浓硫酸溶液。
用喷雾显色法,100℃显色,获最清晰斑点为止。
对出现与标准品有相同迁移率的薄层板进行扫描,扫描条件如下:反射式锯齿形扫描,狭缝为112mm ×1.2mm ,线性参数S x =3,峰检出方式为面积法,灵敏度中,对标准品斑点扫描确定其测定波长为520nm 。
对同一斑点连续扫描4次,取其平均值,可初步估算样品溶液中紫杉醇的含量。
116 高效液相色谱对真菌培养物中紫杉醇含量的 检测 H PL C 色谱仪:B ackm an Go ld H PL C sys 2tem ;检测仪:紫外检测仪。
H PL C 条件:C 218反相柱,415mm ×200mm ,等浓度洗脱;流动相M eO H :H 2O =65∶35,流速1mL m in ;检测波长220nm ;进样量20ΛL 。
2 结 果211 产紫杉醇内生真菌的分离从选用的中国红豆杉树皮中分离出20多株真菌菌株。
薄层层析法分析结果显示,仅有编号为Q T 12的一株内生真菌出现了与标准品迁移率相同的斑点(图1)。
以Q T 12为实验菌株进行形态观察和检测。
212 内生真菌QT 12的生长及形态特征Q T 12菌株的菌丝体为白色,菌丝较细,有横隔,菌丝多分枝,孢子呈短杆状,表面光滑(图2)。
Q T 12在马铃薯固体培养基上生长较快,一般4～5d 可长满直径9c m 的培养皿,菌落表面呈白色,质地呈棉絮状,中间部分形成突起并在周围形成同心环。
213 高效液相色谱测定采用高效液相色谱系统对Q T 12样品溶液进行检测,结果如图3,4所示。
由图3,4可见,样品中峰 与标准品中峰 的保留时间一致,即t R =15.43m in 可判断样品中峰 为紫杉醇的吸收峰。
根据峰 的积分面积计算得出样品中紫杉醇的含量,再根据发酵液总量可计算出Q T 12菌株液体培养物中紫杉醇含量约1412Λg图1 Q T 12内生真菌F ig .1 T he Endophytic Fungu s Q T 12展开剂为二氯甲烷2甲醇(95∶5V V ) 展开剂为乙酸乙脂2异丙醇(96∶4V V )展开剂为氯仿2乙腈(9∶1V V )图2 内生真菌Q T 12的菌丝F ig .2 T he H yphal Cell of the Endophytic Fungu s Q T 12图3 紫杉醇标准品H PL C 图谱F ig .3 Ch rom atogram of H PL C of the T axo l—84— 西北大学学报(自然科学版) 第29卷 图4 Q T 12菌株H PL C 图谱F ig .4 Ch rom atogram of H PL C of Endophytic Fungu s Q T 123 讨 论利用内生真菌来合成紫杉醇是近年来才开展的紫杉醇资源研究的方法之一,尚处于研究的初级阶段。
该项研究的两个关键性问题就是能合成紫杉醇的内生真菌的分离和培养物中紫杉醇产量的提高。
目前这方面的研究还比较少,但是利用内生真菌生产紫杉醇有以下的优点:①真菌一般比生长速率高;②能在简单培养基上生长,易于获得大量培养物;③可在生物反应器中大规模培养,培养条件相对易于控制和掌握等。
本实验是对建立产紫杉醇内生真菌的初筛方法的初步研究,从分离测定的结果看,Q T 12内生真菌合成紫杉醇的量很少,有待于利用现代微生物技术诱变育种及加入紫杉醇的前体物质等方法来提高其产量。
参考文献1 陈毓亨,程克棣1近年来国外紫杉醇资源研究进展1国外医学:药学分册,1994,21(1):36～392 甘烦远,郑光植1红豆杉的细胞工程学研究进展1国外医学:植物药分册,1994,9(4):156～1593 邱德有,黄美娟,朱至清1一株云南红豆杉内生真菌的分离1真菌学报,1984,13(4):314～3164 Stierle A ,Strobei G ,Stierle D .T axo l and taxane p roducti on by T axom yces and reanal ,an endophytic fangu s of paciti 2cyew comm en ts.Science ,1993,260:214～216(编 辑 张银玲)The Study of Isolati ng Endophytic FungusSyn thesiz i ng Taxol from Plan tM A T ianyou DON G Zhao lin(D epartm en t of B i o logy ,N o rthw est U n iversity ,X i ′an ,710069)Abstract A strain of endop hytic fungu s w as iso lated from the taxu s Ch inen sis in the Q in ling m oun tain s .It w as cu ltu red in the liqu id po tato m edium .B y m ean s of the th in layer ch rom atagrap hy ,TL C Scanner ,the cu ltu res w as analyzed and determ ined .T he resu lt show s th is strain of fungu s can p roduce taxo l .T he con ten t of taxo l in the fungu s w h ich w as determ ined by H PL C w as abou t 14.2Λg L .Keywords T axu s Ch inen sis ;Endop hytic fungu s ;T axo l ;T h in layer ch rom atgrap hy ;H PL C—94— 第1期 马天有等:从植物分离产紫杉醇的内生真菌的研究 。