樟脑注射液对糖尿病肾脏的保护作用

氧化樟脑注射液对糖尿病大鼠肾脏的保护作用

韩辅1，邵国喜1*

1 长春中医药大学附属医院内分泌科吉林长春130000

2 吉林大学第二医院骨科吉林长春130000

*通讯作者

摘要：目的探讨氧化樟脑注射液对糖尿病大鼠肾脏损害的保护作用及其机制。方法将 36只大鼠随机分为对照组、糖尿病组和氧化樟脑注射液治疗组(治疗组),后两组制备 2型糖尿病大鼠模型。采用免疫组化技术与流式细胞技术检测肾小管上皮细胞转分化过程中的标志蛋白[0l一平滑肌肌动蛋白(0l—SMA)、波形蛋白(vimentin)及转化生长因子一13．(TGF一13．)]在肾小管上皮细胞中的表达。结果治疗组一SMA,vimentin及 TGF—B．表达均较糖尿病组下调。结论氧化樟脑注射液能延缓糖尿病大鼠的肾间质纤维化。

关键词：糖尿病；糖尿病肾病；肾小管；氧化樟脑注射液

糖尿病肾病 (DN)是糖尿病的严重慢性并发症 ,是导致终末期肾功能衰竭的主要原因 ,预后多数不良,这主要是因为肾脏病变是慢性进行性损害,临床症状出现较晚 ,并且糖尿病引起肾损害的机制尚不完全清楚 ,缺乏良好的治疗药物和有效的干预手段。氧化樟脑注射液对慢性肾功能衰竭氮质血症有较好疗效 ,可通过多种机制延缓慢性肾功能衰竭进展。探讨了氧化樟脑的超临界CO 萃取物Π氧化樟脑注射液对糖尿病大鼠肾脏的保护作用 ,报道如下。

1 材料与方法

1．1 材料动物：清洁级非肥胖雌性 SD大鼠(重庆医科大学动物中心 ,许可证号为 SYXK2002—2202)36只,8周龄 ,体重 180～207g／只 ,饲养于屏障系统中。试药：氧化樟脑注射液(长春大政药业科技有限公司)；链脲佐菌素 (STZ。美国 Sigma公司)。仪器：流式细胞仪 (美国 BD公司 ,FACS420)。

1．2 造模与分组对照组 (NC组 )大鼠 12只 ,普通饲料喂养 ,6周时腹腔注射 I)H值为4．2的等体积枸橼酸缓冲液。其余大鼠24只子高糖、高脂饲料 (普通饲料加蔗糖、熟猪油、鸡蛋、奶粉混合烤熟而成 )喂养 ,6周时腹腔注射 30mg／kg链脲佐菌素(用 pH值为 4．2的0。1mmol／L无菌枸橼酸缓冲液配制),8周时行口服葡萄糖耐量试验(OGTY),异常者入选。成模大鼠共 2O只,其中糖尿病组 (DM组 )9只 ,糖尿病氧化樟脑注射液治疗组 (DMT组 )11只 ,成模率为 83％。

1．3 标本制备与检测12周时,DMT组每13给予氧化樟脑注射液 1．42mg／kg灌胃 ,其余两组每日给予等体积的高压消毒水灌胃。24周时 ,所有大鼠收集 24h尿液 ,保存、待测；麻醉后经腹主静脉取血 ,迅速取出左肾,滤纸吸干水分 ,去包膜,称重,制备大鼠肾脏组织标本。采用免疫组化法进行肾脏组织病理学检测。石蜡包埋 4 m连续切片,按说明书进行染色,DAB显色,脱水 ,透明封片,用磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗作阴性对照,结果以胞浆内出现棕黄色或黄色颗粒判断为阳性 ,根据肾小管上皮细胞的染色范围及强度判断阳性强弱。阳性比率(PI)采用半定量法。应用图像分析仪分析后取均值。采用间接免疫荧光法进行流式细胞学检测12I。用流式细胞仪检测 0l一平滑肌肌动蛋白(0l—SMA)、波形蛋白(vimentin)、转化生长因子一p(TGF—p)的表达,结果按照文献方法 ,以荧光指数 (FI)表示相对含量。

1．4 统计学方法运用 SPSSl1．0软件进行分析 ,结果用 X ±表示 ,P<0．05表示差异有显著性。

2 结果

2．1 血生化指标及尿液检查对 24h尿液和血液进行检测 ,结果见表 1。可见 ,DM组的空腹血糖、胰岛素、甘油三酯、总胆固醇、尿白蛋白分泌率较同期 NC组均显著升高 ,肌酐清除率明显下降 (P<0。01)。DMT 组胰岛素、总胆固醇、尿白蛋白分泌率较同期 DM组均好转(P<0．05),胰岛素下降程度较大 ,接近 NC组水平；空腹血糖、甘油三酯、肌酐清除率有所下降 ,但差异没有统计学意义。

表1各组大鼠一般情况及生化指标比较

组别体重(g) 肾重/体重(g/kg) 空腹血糖(mmol/L) 胰岛素(U/L) 甘油三酯(mmol/L)

NC(N=12) 320±18 3.18±0.21 4.1±0.3 14.57±5.79 1.02±0.24

DM(N=9) 297±22 6.55±1.07 21.4±1.8 25.70±6.98 2.68±0.64

DMT(N=11) 311±25 4.36±1.20 19.2±3.6 18.20±4.20 2.29±0.36

总胆固醇(mmol/L) 肌酐清除率(mL/min) 尿蛋白白分泌率(μg/min)

2.32±0.38 0.280±0.190 0.03±0.03

4.55±1.23 0.054±0.015 0.18±0.05

3.19±0.56 0.049±0.008 0.08±0.03

注:与NC组比较，P<0.05，P<0.01； DM组比较，P<0.05，P<0.01(下表同) 2．2 免疫组化结果结果见表 2。可见 ,NC组大鼠近曲小管上皮细胞胞浆内“α-SMA和 vimentin无表达 ,TGF—B 在胞浆和问质中微量表达；DM组大鼠近曲小管上皮细胞胞浆内有大量棕黄色颗粒 ,0[一SMA,vimentin,TGF—B呈强阳性；与同期 DM组相比 ,DMT组各项指标表达减轻,范围缩小 ,表达水平介于 NC组与 DM组之间。

表2大鼠肾脏细胞免疫组化结果

组别α-SMA TCF-β vimentin

NC(n=12) 0.01±0.02 0.03±0.01 0.02±0.01

DM(n=9) 0.37±0.04 0.33±0.06 0.39±0.01

DMT(n=11) 0.23±0.05 0.23±0.05 0.22±0.03

2 .

3 流式细胞学检查结果 SMAFI相对值 DM组为 l、91±0．08,高于 NC组 1．08±0．03,DMT组为 1．35±0．02,介于前两组之间 ,与 DM组相比差异有统计学意义 (P<0．O1)。TGF—B FI相对值 DM 组为1．88±0．03,高于 NC组 1．0l±0．02(P<0．01),DMT组为 1．28±0．02,比 DM组低 ,差异有统计学意义 (尸<0．O1)。

3 讨论

近年来对 DN的研究发现 ,肾小管上皮细胞表型转化一肌成纤维细胞转分化(TEMT)在肾小管病变、小管问质纤维化的发生、发展中起着非常重要的作用。氧化樟脑注射液可以改善慢性肾功能衰竭患者的氮质血症 ,其有效成分是Π氧化樟脑。氧化樟脑主要是通过促进蛋白质合成 ,抑制蛋白质分解 ,促进尿素、肌酐排泄和减少合成尿素的来源等途径影响慢性肾功能衰竭患者体内氮质代谢。目前普遍认为,残存肾单位的代偿性肥大和高代谢状态是造成慢性肾功能衰竭进行性恶化的重要机制 1,因此 ,抑制肾脏代偿性肥大 ,降低其高代谢水平将有助于减少肾小球硬化的发生 ,延缓慢性肾功能衰竭的进展。氧化樟脑能抑制肾脏代偿性肥大和高代谢状态。氧化樟脑还可抑制系膜细胞(MsC)的增殖而有助于延缓慢性肾功能衰竭的进展 ,这是通过抑制细胞 DNA和蛋白质合成作用实现的。氧化樟脑可以纠正慢性肾功能衰竭患者的脂质代谢紊乱 ,使甘油三酯含量下降、血清高密度脂蛋白明显升高 ,还可抑制血清胆固醇的沉积而降低血管的通透性。研究发现 ,氧化樟脑注射液能促进胆汁排出 ,增强胃肠道蠕动 ,从而减轻胆固醇在体内的蓄积 1。

氧化樟脑注射液对 2型糖尿病大鼠进行干预治疗 ,结果显示 ,虽然血糖下降不明显 ,但是胰岛素、总胆固醇明显下降 ,肾功能好转 ,且近曲小管上皮细胞胞浆中 d—SMA,vimentin,TGF一8。表达减少 ,说明氧化樟脑注射液对 DN的作用可以不依赖于降低血糖。这与 Yoshimoto等和 Nakamura等的研究结果一致。有学者在 1型糖尿病大鼠模型中发现 ,噻唑烷二酮TZD)中的曲格列酮对血糖、胰岛素浓度并无影响 ,但仍能明显降低尿白蛋白分泌率。说明 TZD除对代谢有影响外 ,还可通过其他方式作用于肾脏。

试验中还发现 DM组大鼠肾重／体重之比(肾脏肥大指数)明显高于 NC组及 DMT组 ,提示糖尿病模型大鼠肾脏肥大,与文献报道一致“。

过氧化酶体增殖剂激活受体 y(PPAR一^y)主要分布于脂肪组织 ,但最近有研究发现肾小球、肾皮质非小球部位及皮质中均存在PPAR一^y,这为氧化樟脑注射液直接作用于肾脏提供了必要条件。有学者在对单侧输尿管梗阻大鼠间质纤维化模型(UUO)的研究中发现：DMT+UUO组左侧肾脏的病理改变及肾间质纤维化程度明显减轻(P<0．05),肾小管上皮细胞。一SMA的表达显著减少(P<0．05),说明氧化樟脑注射液对 UUO所致大鼠肾间质纤维化具有保护作用 ,其机制可能是通过减少 TEMT而改善肾间质纤维化”。

综上所述 ,氧化樟脑注射液可以直接作用于肾脏 ,通过减轻 TEMT而延缓间质纤维化的发展 ,保护肾脏。

参考文献：

[1]SpencerDM,Markham A．Troglitazone[J]．Drugs,2004,54：89—101．

[2]Morkve 0,Laerun OD．Flow cytometric measurementof P53 proteinexpression and DNA contentin parafin embedded tissue from bronchialcarcinomas[J]．Cytometry．2001,12：438—441．

[3]黄敬泽 ,王健．2型糖尿病人血清肿瘤坏死因子的变化 [J]．免疫学杂志 ,1999,15(4)：256—257．

[41Flyvberg A,Gronbaek H．Bak M,etai．Diabetic kidneydisease：The roleofgrowthfactors[J]．NephrolDialTransplant,2002．13：1104—1107

[5]AndersonS,RennkeHG,BrennerBM,etai．Nifedipineversusfosinopriiinaninephrectomizeddiabencrat s[J]．Kidneylnt,2002,41：891—897．