DNA的定量测定-二苯胺法
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DNA的定量测定-二苯胺法
一、目的
学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。
二、原理
DNA分子中的脱氧核糖基,在酸性溶液中变成-羟基-a-酮基戊糖,与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物,在一定波长范围内,化合物蓝色的深浅与DNA的含量成比例关系,可用比色法测定。
三、实验仪器
(1)试管
(2)移液管
(3)7220分光光度计
四、实验试剂
1、DNA标准液(200ug/ml):称取10mgDNA钠盐溶于5mol/l氢氧化钠溶液并稀释至100ml。
2、二苯胺试剂:
A液:称取纯二苯胺1.50g,溶于100ml冰乙酸,再加浓硫酸1.5ml。贮于棕色瓶中。
B液:称取1.6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中,临用时配制
临用时,将20mlA液和0.1mlB液混合即可
五、实验步骤
1.标准曲线的绘制
取干燥的试管6支,编号,按下表加入试剂:
加毕,混匀,在60度水浴中保温45分钟,冷却后,在595nm波长下测吸光度,以吸光度对DNA浓度作标准曲线。
2.样品测定
吸取DNA样液1ml,加入二苯胺溶液2.0ml, 加毕,混匀,在60度水浴中保温45分钟,冷却后,在595nm波长下测吸光度,根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。
六、实验结果
1 2 3 4 5 样液
吸光度0.008 0.023 0.07 0.096 0.111 0.095
曲线绘制如下:
DNA标准液浓度200ug/ml
所以据图
得到样液中DNA155.379微克。
七、实验分析
1、此方法测定DNA 含量灵敏度不高,若是DNA含量低于50ug/ml, 则难以测定。
2、样品中少量的RNA并不影响测定, 但是蛋白质, 多糖及其衍生物, 芳香醛, 羟基醛等能与二苯胺反应成有机物,干扰DNA的定量。
3、实验中加入乙醛的作用是什么,请详细说明?
可以提高二苯胺法中DNA的发色量.
减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰,提高灵敏度.