DNA的定量测定-二苯胺法

DNA的定量测定-二苯胺法

一、目的

学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。

二、原理

DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成-羟基-a-酮基戊糖，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物，在一定波长范围内，化合物蓝色的深浅与DNA的含量成比例关系，可用比色法测定。

三、实验仪器

(1)试管

(2)移液管

(3)7220分光光度计

四、实验试剂

1、DNA标准液（200ug/ml）：称取10mgDNA钠盐溶于5mol/l氢氧化钠溶液并稀释至100ml。

2、二苯胺试剂：

A液：称取纯二苯胺1.50g，溶于100ml冰乙酸，再加浓硫酸1.5ml。贮于棕色瓶中。

B液：称取1.6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中，临用时配制

临用时，将20mlA液和0.1mlB液混合即可

五、实验步骤

1.标准曲线的绘制

取干燥的试管6支，编号，按下表加入试剂：

加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，以吸光度对DNA浓度作标准曲线。

2.样品测定

吸取DNA样液1ml，加入二苯胺溶液2.0ml, 加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。

六、实验结果

1 2 3 4 5 样液

吸光度0.008 0.023 0.07 0.096 0.111 0.095

曲线绘制如下：

DNA标准液浓度200ug/ml

所以据图

得到样液中DNA155.379微克。

七、实验分析

1、此方法测定DNA 含量灵敏度不高,若是DNA含量低于50ug/ml, 则难以测定。

2、样品中少量的RNA并不影响测定, 但是蛋白质, 多糖及其衍生物, 芳香醛, 羟基醛等能与二苯胺反应成有机物,干扰DNA的定量。

3、实验中加入乙醛的作用是什么，请详细说明？

可以提高二苯胺法中DNA的发色量.

减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰，提高灵敏度.