DNA的定量测定-二苯胺法

合集下载
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。

DNA的定量测定-二苯胺法

一、目的

学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。

二、原理

DNA分子中的脱氧核糖基,在酸性溶液中变成-羟基-a-酮基戊糖,与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物,在一定波长范围内,化合物蓝色的深浅与DNA的含量成比例关系,可用比色法测定。

三、实验仪器

(1)试管

(2)移液管

(3)7220分光光度计

四、实验试剂

1、DNA标准液(200ug/ml):称取10mgDNA钠盐溶于5mol/l氢氧化钠溶液并稀释至100ml。

2、二苯胺试剂:

A液:称取纯二苯胺1.50g,溶于100ml冰乙酸,再加浓硫酸1.5ml。贮于棕色瓶中。

B液:称取1.6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中,临用时配制

临用时,将20mlA液和0.1mlB液混合即可

五、实验步骤

1.标准曲线的绘制

取干燥的试管6支,编号,按下表加入试剂:

加毕,混匀,在60度水浴中保温45分钟,冷却后,在595nm波长下测吸光度,以吸光度对DNA浓度作标准曲线。

2.样品测定

吸取DNA样液1ml,加入二苯胺溶液2.0ml, 加毕,混匀,在60度水浴中保温45分钟,冷却后,在595nm波长下测吸光度,根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。

六、实验结果

1 2 3 4 5 样液

吸光度0.008 0.023 0.07 0.096 0.111 0.095

曲线绘制如下:

DNA标准液浓度200ug/ml

所以据图

得到样液中DNA155.379微克。

七、实验分析

1、此方法测定DNA 含量灵敏度不高,若是DNA含量低于50ug/ml, 则难以测定。

2、样品中少量的RNA并不影响测定, 但是蛋白质, 多糖及其衍生物, 芳香醛, 羟基醛等能与二苯胺反应成有机物,干扰DNA的定量。

3、实验中加入乙醛的作用是什么,请详细说明?

可以提高二苯胺法中DNA的发色量.

减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰,提高灵敏度.

相关文档
最新文档