转基因马铃薯植株的抗性筛选及其PCR鉴定
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ＰＣＲ 技术是在生物体外快速扩增目的基因 片段并进行初步检测的有效方法[３] ꎬ可放大目的 ＤＮＡ 片段的分子生物学技术ꎮ 产物经琼脂凝胶 电泳ꎬ溴化乙锭染色后会很容易观察ꎬ不需通过杂 交分析就可以鉴定出基因组中是否存在目的序 列ꎬ具有灵敏度高ꎬ简便、快速等特点ꎮ 因此这项 技术被广泛用于转化及抗性筛选所得生物体的筛 选鉴定ꎮ
摘 要:近年来ꎬ 转基因技术研究发展很快ꎬ 筛选、鉴定转基因植株是基因转移的必须环节ꎮ 本实验利用农 杆菌( 含有 ｐＡＲＴＧＦ 植物表达载体) 介导法将外源基因转入马铃薯植株ꎬ经过含有卡那霉素培养基的抗性筛 选ꎬ初步筛选出转基因马铃薯植株 Ａ、Ｂ、Ｃ 分别为 ５ 株、７ 株、８ 株ꎻ将筛选的转基因马铃薯植株利用 ＰＣＲ 进行 检测ꎬ经分析ꎬ其结果初步表明ꎬ已成功将目的基因转入马铃薯基因组中ꎬ并获得阳性植株分别为 ２ 株、４ 株、 ５ 株ꎮ 关键词:转基因ꎻＰＣＲꎻ马铃薯ꎻ转基因鉴定
马铃薯作为世界上第四大粮食作物ꎬ在人民 生活和农业生产中占有重要地位ꎮ 马铃薯植株具 有易生长、生物量大ꎻ遗传体系较完善、转化周期 短ꎻ可通过无性繁殖获得转化基因植株等特点而 备受科研工作者青睐ꎮ 马铃薯是最早进行转基因 研究的植物ꎬ也是田间实验品种最多的转基因作 物之一[１] ꎮ 目前ꎬ有很多种方法可获得转基因植 株ꎬ无论哪种方法ꎬ最终的结果都是转化细胞只能 占少数ꎬ可以通过筛选转化细胞ꎬ确定转化植株ꎮ 可以通过检测标记基因ꎬ来证明目的基因的存在ꎮ 目前ꎬ应用最广的标记基因为 ＮＰＴⅡ基因ꎬ其编码 产物可使氨基糖苷类抗生素磷酸化而失活( 如: 新霉素、卡那霉素等) ꎬ植物会产生相应的抗生素 抗性ꎬ 因此可利用卡那霉素对转化植株进行筛 选[２] ꎮ 植株也可能会逃避选择成为假转化体ꎬ因 此ꎬ还需对卡那霉素筛选后的转基因植株中的外 源基因进行进一步的检测ꎮ
收稿日期:２０１８￣０１￣０２ 修回日期:２０１８￣０２￣２３ 作者简介:张萍(１９８３￣) ꎬ女ꎬ陕西永寿人ꎬ咸阳职业技术学院讲师ꎬ研究方向:生物技术ꎮ
������３９������
陕西农业科学 ２０１８ 年第 ６４ 卷第 ５ 期
１. ４ 培养基 ＭＳ 母液[６] 配制方法: 母液Ⅰ ( ２０ × ) : 每 升 含 ３３ ｇ ＮＨ４ ＮＯ３ 、３８ ｇ
陕西农业科学 ２０１８ꎬ６４(０５) :３９ － ４２ Ｓｈａａｎｘｉ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
转基因马铃薯植株的抗性筛选及其 ＰＣＲ 鉴定
张 萍 ( 咸阳职业技术学院ꎬ陕西 咸阳 ７１２０００)
ＴａｑＤＮＡ 聚 合 酶 ( 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司) ꎻ
标准 ＤＮＡ 分 子 量 Ｍａｒｋｅｒ Ⅴ、 ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００ ( 天为时代公司) ꎻ
引物 ｇｌ － １ / ｇｌ － ６ꎬＧ１ / ｇｌ － ６ꎬ其组成见表 １ꎮ
表 １ 扩增所用引物及构成
引物 ｇｌ － １ ｇｌ － ６
母液 Ⅲ ( １００ × ) : 每 升 含 ５. ５６ ｇＦｅＳＯ４ ������ ７Ｈ２ Ｏ、７. ４ ｇＮａ２ ������ＥＤＴＡ������２Ｈ２ Ｏꎻ
母液Ⅳ(２００ × ) :每升含 ０. １ ｇ 烟酸、０. １ ｇ 盐 酸吡哆醇、０. ４ ｇ 甘氨酸、０. ０２ ｇＶＢ１ ꎻ
(１) ＭＳ１ 培养基:用于马铃薯组织培养苗继 代培养ꎬ在 ＭＳ 培养基的基础上肌醇含量增加至 １４０ ｍｇ������ Ｌ － １ 、 蔗 糖 含 量 增 加 至 ３０ ｇ ������ Ｌ － １ 配 制 而成ꎮ
笔者实验对经卡那霉素抗性筛选ꎬ将筛选所 得抗性苗、相应的未经转化的马铃薯茎段( 作为 对照) 为材料ꎬ利用 ＰＣＲ 技术进行进一步鉴定ꎬ筛 选鉴定出转化植株ꎬ并进行移栽ꎬ以便进一步的
研究ꎮ
１ 材料
１. １ 植物材料 愈伤组织分化苗( 经工程农杆菌转化的 Ａ、
Ｂ、Ｃ 马铃薯茎段所得)ꎻ未进行转化的对应的马 铃薯试管苗ꎮ １. ２ 引物及酶
１. ３ 抗生素及其配制 (１) 头孢霉素(２５０ ｍｇ������ｍＬ － １ ) :称取 ５ ｇ 头
孢霉素溶解于无菌蒸馏水中ꎬ 定容至 ２０ ｍＬꎬ 用 ０. ２２ ｕｍ 滤膜过滤分装ꎬ － ２０℃ 保存ꎮ
(２) 卡那霉素(１００ ｍｇ������ｍＬ － １ ) :称取 ２ ｇ 卡 那霉素溶解于无菌蒸馏水中ꎬ 定容至 ２０ ｍＬꎬ 用 ０. ２２ ｕｍ 滤膜过滤分装ꎬ － ２０℃ 保��２Ｈ２ Ｏ、７. ４ ｇ ＭｇＳ ������７Ｈ２ Ｏ、 ３. ４ ｇＫＨ２ ＰＯ４ ꎻ
母液Ⅱ(２００ × ) :每升含 ０. １６６ ｇ ＫＩ、４. ４６ ｇ ＭｎＳＯ４ ������ ４Ｈ２ Ｏ、１. ２４ ｇ Ｈ３ ＢＯ３ 、 １. ７２ ｇ ＺｎＳＯ４ ������ ７Ｈ２ Ｏ、０. ０５ ｇ Ｎａ２ ＭｏＯ４ ������２Ｈ２ Ｏ、０. ００５ ｇ ＣｏＣＬ２ ������ ６Ｈ２ Ｏ、０. ０５ ｇ ＣａＳＯ４ ������５Ｈ２ Ｏꎻ
(２) ＭＳ２ 抗性筛选培养基:对转基因马铃薯 植株进行抗性筛选ꎬ在 ＭＳ１ 培养基的基础上加入 ７０ ｍｇ������Ｌ － １ Ｋｍ 配制而成ꎮ
(３) ＭＳ３ 生根培养基:诱导外植体形成根系ꎬ 在 ＭＳ１ 培养基的基础上添加 ７０ ｍｇ������Ｌ － １ Ｋｍ 和 ３００ ｍｇ������Ｌ － １ 头抱霉素配制而成ꎮ １. ５ 琼脂糖凝胶电泳缓冲液及 ＥＢ 染色液
Ｇ１
引物序列(５'－ ３') ＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＴＧ ＧＣＡ ＡＧＣ ＡＴＣ ＡＣＡ ＧＣＴ ＴＣ ＧＣ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＧＴ ＡＣＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ＣＧＧ ＴＧＴ ＡＴＴ ＴＴＴ ＡＴＣ Ｇ ＧＣ ＧＡＧＣＴＣ ＧＣＧＧＣＣＧＣ ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＧＧ ＡＧＡ ＣＡＴ ＧＴＴ ＡＴＧ Ａ
摘 要:近年来ꎬ 转基因技术研究发展很快ꎬ 筛选、鉴定转基因植株是基因转移的必须环节ꎮ 本实验利用农 杆菌( 含有 ｐＡＲＴＧＦ 植物表达载体) 介导法将外源基因转入马铃薯植株ꎬ经过含有卡那霉素培养基的抗性筛 选ꎬ初步筛选出转基因马铃薯植株 Ａ、Ｂ、Ｃ 分别为 ５ 株、７ 株、８ 株ꎻ将筛选的转基因马铃薯植株利用 ＰＣＲ 进行 检测ꎬ经分析ꎬ其结果初步表明ꎬ已成功将目的基因转入马铃薯基因组中ꎬ并获得阳性植株分别为 ２ 株、４ 株、 ５ 株ꎮ 关键词:转基因ꎻＰＣＲꎻ马铃薯ꎻ转基因鉴定
马铃薯作为世界上第四大粮食作物ꎬ在人民 生活和农业生产中占有重要地位ꎮ 马铃薯植株具 有易生长、生物量大ꎻ遗传体系较完善、转化周期 短ꎻ可通过无性繁殖获得转化基因植株等特点而 备受科研工作者青睐ꎮ 马铃薯是最早进行转基因 研究的植物ꎬ也是田间实验品种最多的转基因作 物之一[１] ꎮ 目前ꎬ有很多种方法可获得转基因植 株ꎬ无论哪种方法ꎬ最终的结果都是转化细胞只能 占少数ꎬ可以通过筛选转化细胞ꎬ确定转化植株ꎮ 可以通过检测标记基因ꎬ来证明目的基因的存在ꎮ 目前ꎬ应用最广的标记基因为 ＮＰＴⅡ基因ꎬ其编码 产物可使氨基糖苷类抗生素磷酸化而失活( 如: 新霉素、卡那霉素等) ꎬ植物会产生相应的抗生素 抗性ꎬ 因此可利用卡那霉素对转化植株进行筛 选[２] ꎮ 植株也可能会逃避选择成为假转化体ꎬ因 此ꎬ还需对卡那霉素筛选后的转基因植株中的外 源基因进行进一步的检测ꎮ
收稿日期:２０１８￣０１￣０２ 修回日期:２０１８￣０２￣２３ 作者简介:张萍(１９８３￣) ꎬ女ꎬ陕西永寿人ꎬ咸阳职业技术学院讲师ꎬ研究方向:生物技术ꎮ
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陕西农业科学 ２０１８ 年第 ６４ 卷第 ５ 期
１. ４ 培养基 ＭＳ 母液[６] 配制方法: 母液Ⅰ ( ２０ × ) : 每 升 含 ３３ ｇ ＮＨ４ ＮＯ３ 、３８ ｇ
陕西农业科学 ２０１８ꎬ６４(０５) :３９ － ４２ Ｓｈａａｎｘｉ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
转基因马铃薯植株的抗性筛选及其 ＰＣＲ 鉴定
张 萍 ( 咸阳职业技术学院ꎬ陕西 咸阳 ７１２０００)
ＴａｑＤＮＡ 聚 合 酶 ( 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司) ꎻ
标准 ＤＮＡ 分 子 量 Ｍａｒｋｅｒ Ⅴ、 ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００ ( 天为时代公司) ꎻ
引物 ｇｌ － １ / ｇｌ － ６ꎬＧ１ / ｇｌ － ６ꎬ其组成见表 １ꎮ
表 １ 扩增所用引物及构成
引物 ｇｌ － １ ｇｌ － ６
母液 Ⅲ ( １００ × ) : 每 升 含 ５. ５６ ｇＦｅＳＯ４ ������ ７Ｈ２ Ｏ、７. ４ ｇＮａ２ ������ＥＤＴＡ������２Ｈ２ Ｏꎻ
母液Ⅳ(２００ × ) :每升含 ０. １ ｇ 烟酸、０. １ ｇ 盐 酸吡哆醇、０. ４ ｇ 甘氨酸、０. ０２ ｇＶＢ１ ꎻ
(１) ＭＳ１ 培养基:用于马铃薯组织培养苗继 代培养ꎬ在 ＭＳ 培养基的基础上肌醇含量增加至 １４０ ｍｇ������ Ｌ － １ 、 蔗 糖 含 量 增 加 至 ３０ ｇ ������ Ｌ － １ 配 制 而成ꎮ
笔者实验对经卡那霉素抗性筛选ꎬ将筛选所 得抗性苗、相应的未经转化的马铃薯茎段( 作为 对照) 为材料ꎬ利用 ＰＣＲ 技术进行进一步鉴定ꎬ筛 选鉴定出转化植株ꎬ并进行移栽ꎬ以便进一步的
研究ꎮ
１ 材料
１. １ 植物材料 愈伤组织分化苗( 经工程农杆菌转化的 Ａ、
Ｂ、Ｃ 马铃薯茎段所得)ꎻ未进行转化的对应的马 铃薯试管苗ꎮ １. ２ 引物及酶
１. ３ 抗生素及其配制 (１) 头孢霉素(２５０ ｍｇ������ｍＬ － １ ) :称取 ５ ｇ 头
孢霉素溶解于无菌蒸馏水中ꎬ 定容至 ２０ ｍＬꎬ 用 ０. ２２ ｕｍ 滤膜过滤分装ꎬ － ２０℃ 保存ꎮ
(２) 卡那霉素(１００ ｍｇ������ｍＬ － １ ) :称取 ２ ｇ 卡 那霉素溶解于无菌蒸馏水中ꎬ 定容至 ２０ ｍＬꎬ 用 ０. ２２ ｕｍ 滤膜过滤分装ꎬ － ２０℃ 保��２Ｈ２ Ｏ、７. ４ ｇ ＭｇＳ ������７Ｈ２ Ｏ、 ３. ４ ｇＫＨ２ ＰＯ４ ꎻ
母液Ⅱ(２００ × ) :每升含 ０. １６６ ｇ ＫＩ、４. ４６ ｇ ＭｎＳＯ４ ������ ４Ｈ２ Ｏ、１. ２４ ｇ Ｈ３ ＢＯ３ 、 １. ７２ ｇ ＺｎＳＯ４ ������ ７Ｈ２ Ｏ、０. ０５ ｇ Ｎａ２ ＭｏＯ４ ������２Ｈ２ Ｏ、０. ００５ ｇ ＣｏＣＬ２ ������ ６Ｈ２ Ｏ、０. ０５ ｇ ＣａＳＯ４ ������５Ｈ２ Ｏꎻ
(２) ＭＳ２ 抗性筛选培养基:对转基因马铃薯 植株进行抗性筛选ꎬ在 ＭＳ１ 培养基的基础上加入 ７０ ｍｇ������Ｌ － １ Ｋｍ 配制而成ꎮ
(３) ＭＳ３ 生根培养基:诱导外植体形成根系ꎬ 在 ＭＳ１ 培养基的基础上添加 ７０ ｍｇ������Ｌ － １ Ｋｍ 和 ３００ ｍｇ������Ｌ － １ 头抱霉素配制而成ꎮ １. ５ 琼脂糖凝胶电泳缓冲液及 ＥＢ 染色液
Ｇ１
引物序列(５'－ ３') ＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＴＧ ＧＣＡ ＡＧＣ ＡＴＣ ＡＣＡ ＧＣＴ ＴＣ ＧＣ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＧＴ ＡＣＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ＣＧＧ ＴＧＴ ＡＴＴ ＴＴＴ ＡＴＣ Ｇ ＧＣ ＧＡＧＣＴＣ ＧＣＧＧＣＣＧＣ ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＧＧ ＡＧＡ ＣＡＴ ＧＴＴ ＡＴＧ Ａ