病原微生物分子分型技术研究进展

病原微生物分子分型技术研究进展

现代分子分型技术主要包括质粒DNA图谱分析、限制性内切酶消化后的染色体DNA 分析、核酸探针杂交、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、PCR和多位点序列分析(MLST)技术。DNA 重复序列PCR技术(Rep-PCR)的实用性强、低用费、可再现性好，可用来进行普查工作。PFGE 技术分辨力高，是病原微生物分子分型的最佳选择。而有更高分辨力和再现力的MLST新技术正在逐渐被使用。这些分子分型技术将有助于在全球范围内进行病原微生物流行病学研究。本文对近年来常用的病原微生物分子分型技术的研究进展作一综述。

一.评估分型技术标准的可行性

评估一项分型技术是否可行的标准有2个：完成标准(有效性)和便利标准(效率性)。完成标准包括分型能力、分辨力和分型技术间的一致性，而便利标准包括通用性、快捷性、解释和执行的容易程度。一项分型技术的分型能力意味着通过这项分型技术，分离株被划分为所属类型的比例。再现性是指通过这种技术对同种样品在重复检测时，产生相同结果的能力。分辨力是指拥有一致的或非常相似的相关图谱的分离株事实上具有相同的传播途径的可能性。2种分型技术的一致性通过使用这些技术把高度相似的分类株分组归类而被评价〔1，2〕。因此，对一种分型技术来说首选标准是有效性〔3〕。当应用于细菌病原菌时，一种分型技术必须要有效率性优点。通用性就是用于任何病原菌的能力，这对于医源性病原菌感染的研究是一个非常重要的优点。操作和解释结果的容易度以及所需费用、试剂和仪器的可行性都是选择一项分型技术的重要标准〔2-4〕。

二.现代分子分型技术

1.质粒DNA图谱分型技术

细菌质粒分析是较早被使用的对病原微生物流行病学进行调查的分子分型技术〔4〕。这种技术包括萃取质粒DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA。这是一种容易操作和理解的技术。由于不同菌株质粒DNA序列和大小不同，通过琼脂糖凝胶电泳分离得到的DNA质粒图谱也将不同，因此，与流行病相关的分离株能够被分类分型。质粒图谱分析的再现性和分辨力可通过限制性内切酶消化质粒而提高。支持这个方案的理论是，虽然2个不相关质粒有相同的分子量，限制性内切酶位点的位置和频率是不同的。但此技术也有应用局限，质粒是可移动的非染色体遗传物质，细菌能自发的失去或很容易的获得，结果流行病相关的菌株可以展示不同质粒指纹图谱。许多质粒带有抗性决定因子的基因，存在于转位子上，而转位子很容易丢失或获得，这同样可以迅速改变质粒DNA组成。产生图谱的再现性也会由于质粒空间存在的不一致性(超螺旋的、断口的和线形的)而被影响，而凝胶电泳时具有不同迁移速度。大多数病原微生物有质粒，但没有质粒的就不能用此技术分型。此外，由于有些分离株中含有1个或2个质粒，会使菌株间的分辨力降低〔4〕。

2.染色体DNA限制性内切酶分析技术

染色体DNA经限制性核酸内切酶消化，消化后的片段再通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。用限制性内切核酸酶BglⅡ和EcoRI等消化病原微生物基因组DNA，因为它们对染色体上的酶切位点非常敏感，可以产生大量短的片段。电泳后，将获得一系列被分离的DNA图谱。通过比较图谱，就可以进行菌相似性研究。几乎所有的病原微生物分离株都可以通过这种方法分型，但由于基因组DNA巨大，酶切后产生的片段众多，且含有大量的重叠片段，这将导致菌株间图谱一致性分析产生困难〔4〕。

3.核酸探针杂交技术

用高效率的限制性内切核酸酶消化染色体DNA后，染色体就被分解成一系列不同大小的片段，具有一定的片段长度多态性。由于片段太多(包括上述的重叠片段)，给分型带来困难。这种分型困难可以通过印迹杂交解决。有报道，以印迹法为基础的针对金黄色葡萄球菌进行分型研究的2次分型法〔4〕，首先是通过金黄色葡萄球菌染色体DNA随机扩增而制备一些探针，再使用几株菌检验探针的特异性，并选择出有效的探针。使用2次筛选到的探针与分离株进行杂交，根据是否杂交，对分离株进行分型，效果良好。

4.染色体DNA的脉冲场凝胶电泳分型技术

PFGE分型技术是〔5〕使用对染色体有很少酶切位点的限制性核酸内切酶消化细菌DNA，产生大的DNA片段(10～800kb)，这些大片段不能通过常规电泳方法进行有效分离。在电场方向周期改变(脉冲)的凝胶电泳条件下，DNA片段根据大小有效分离。PFGE产生的染色体DNA图谱比用那些高频率切割的限制性内切酶产生的图谱更为简单清晰〔6〕。理论上，所有的细菌都能使用PFGE进行分型分类，结果具有极高的再现性和分辨率，鉴于PFGE 技术的一系列优点，一些人把其视为一种理想的分型技术，并推荐作为对金黄色葡萄球菌等病原微生物分型的最优标准技术〔4〕。使用PFGE也有一些局限，例如所需时间长，使用的试剂非常昂贵，要求专门的仪器等。另外，很小的电泳条件的不同就可以改变每条光谱带间距离，使用不同凝胶进行电泳得到的结果也比较复杂，这为不同实验室间的结果比较带来一定麻烦〔7〕

5.聚合酶链反应技术

聚合酶链反应(PCR)是一种高灵敏度的体外扩增DNA片段的技术，近年来在病原微生物分型研究上也得到了广泛应用。而且，科学家根据微生物基因组特点及分型工作的需要，对PCR技术进行了一系列的改良，使其成为了快速、简捷的分型技术。目前，常用的PCR 分型技术有随机扩增的多态性DNA技术(RAPD)和重复序列PCR技术(Rep-PCR)。RAPD是一种典型PCR衍生技术，用一系列任意的核苷酶序列(10个碱基)作为引物，通过引物与模板DNA序列随机配对进行PCR扩增。由于引物较短，所以退火温度要求较低。扩增时只有距离最近、方向相反的2个引物之间的模板DNA区段才能被扩增。因此，基因组在这些区段如发生了DNA片段缺失、插入或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化。通过电泳对扩增产物DNA片段的多态性进行检测、分析就可以反应出不同菌株基因组的DNA特点，从而对他们进行分型。RAPD技术的使用范围也非常广，分辨结果也有较好的实验室再现性。与其他技术相比，这种技术的优势是它的简便性和快捷性。分辨力依靠引物的数据和核苷酸序列而改变。使用单引物具有低分辨力，但是使用3个或3个以上引物时，会使获得最终结果所需时间大大减少〔8，9〕。虽然RAPD的分型结果在不同实验室间变化较大，分辨力不如PFGE技术，但在疾病暴发流行时，PAPD仍是一种分析相关菌株和排除不相关菌株的良好技术〔10〕。Rep-PCR技术是利用细菌基因组中广泛分布的短重复序列为引物靶序列，进行PCR扩增，通过对PCR产物电泳结果的比较，分析菌株间基因组存在的差异〔11〕。这些重复序列在原核生物界广泛存在，这一些细菌属和种中是保守的。在这种方式获得的图谱中，光谱带的大小和数量的不同代表着不同菌株重复序列间的距离和重复序列的数量，该技术对于大量或少量的菌株分型均适用，简单易行。与其他分类技术相比，这种技术有更高的分辨力。研究表明，虽然有时Rep-PCR分辨力稍低，但与PFGE获得的结果确有很好的关联度。最近已经有人把Rep-PCR与其他已经用于菌株分类的基因分型技术相比较。分析结果显示，Rep-PCR与RAPD和PFGE有相同的分辨力〔12〕。与RAPD 相比，Rep-PCR在DNA提纯中需要一额外步聚。因此，RAPD技术比Rep-PCR稍微简单快速。然而Rep-PCR技术的再现性非常好，这是RAPD无法比拟的。与PFGE相比，Rep-PCR 主要的优点是操作中简便和快捷。而再现性PFGE相似。