大鼠原代心肌细胞分离

分离大鼠原代心肌细胞
概述：
整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，大鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。

大鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。

材料：
1、培养液：1：1 混合的DMEM / F12 培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素。

2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05% ，用pH 7.2-7.8 的D-Hanks溶液配制，-20 ℃保存。

3、D-Hanks溶液（pH 7.2-7.8）：KCl 0.4 g 、KH2PO4 0.06 g 、NaCl 8.00g 、NaHCO3 0.35 g 、Na 2HPO4•7H2O 0.09 g 、酚红0.01 g 1L。

方法：
1、所有器械（四把镊子两把剪刀）放在75%酒精中浸泡6 h以上。

2、用D-Hanks溶液（过滤灭菌）配制0.1%胰酶15 mL备用（胰酶原液0.25%）。

3、新生（2-3天）vistar乳大鼠20只，器械在酒精灯上灼烧消毒备用。

4、准备两个冰盒，在其中一个冰盒中放两个平皿，皿内盛放D-Hanks 溶液（无色），把灼烧后的一把镊子倒插在该冰盒中（用于涮洗心脏）。

另一个冰盒中同样放两个平皿，其一放D-Hanks溶液，其二放1
mL0.1%胰酶，同样把灼烧后的一把镊子和一把剪刀（用于剪碎心脏）倒插在该冰盒中，所剩的两把镊子和一把剪刀灼烧后倒置用于解剖，切勿污染。

5、乳鼠两只一组处死消毒取样，方法：将其轮流放入装有75%酒精
的烧杯中6 s即可。

6、从胸骨下端开始向上解剖乳鼠，剪至颈部，打开胸腔，挤出心脏，用镊子取心脏心室部分放入第一个成有D-Hanks溶液的平皿中，速度越快越好，以保持心肌细胞的活性。

7、待取完所有心脏后，在冰盒中使用冰盒中的镊子涮洗和挤压心脏以尽量除去心脏中的血液，置于冰盒中的另一个平皿中，继续洗去血液，若有心脏上存有心房则用镊子拔去，可使用第二个冰盒中的镊子，依次放入第三个皿（第二个冰盒）中洗净。

8、将洗净的心脏放入第四个放有1 mL 0.1%胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶中，用剪刀剪碎心脏后，吸入所剩的14 mL胰酶中4 ℃消化过夜。

9、消化过夜后，吸出9 mL胰酶，加入9 mL0.1%的胶原酶Ⅱ（此时浓度为0.06%，配胶原酶需用0.2 μm滤器过滤），将15 mL的细胞液装入高压过的小烧杯中，加入磁力棒，在磁力搅拌器上搅拌30 min，温度维持在34 ℃左右，100—120 rpm。

10、配制两种培养液，DMEM-F1210%FBS，DMEM-F12 15%FBS Brdu （1 mg/mL的Brdu母液，在DMEM-F1215%FBS中每2mL加67 μL，心肌细胞对Brdu的耐受性较其他细胞高，以保护心肌细胞减少其他细胞主要是成纤维细胞的污染）。

11、消化30 min后可见细胞粘稠物附在磁力棒上说明消化较充分，将消化液吸入到10 mL DMEM-F12 10%FBS的培养基中，轻微吸打后，1000 rpm，10 min（血清可终止消化）。

12、弃上清，细胞沉淀中加入5 mL DMEM-F12 10%PBS再洗一次，1000 rpm，6 min。

13、弃上清。

用20 mL DMEM-F12 15%FBS Brdu洗细胞，用200目筛将细胞液过滤至两平皿中，10 mL/皿，培养箱培养2 h。

（此步因为成纤维细胞较心肌细胞早贴壁，用差速贴壁的方式消除成纤维细胞）
14、准备两个100 mm皿，在一个皿中吸入2 mL明胶，将明胶吸打使其覆盖整个皿底，所剩明胶吸入到另一个皿，重复操作3次，使两皿底铺满明胶，晾干。

明胶作用是便于心肌细胞更好的贴壁。

15、两小时后，显微镜下可见有部分细胞贴壁，将悬浮的细胞和液体吸入到一个50 mL的离心管中，用吸管轻轻吹打以打散细胞团，然后分装入已铺好明胶的两皿中，每皿10 mL。

16、24 h后，显微镜下可见跳动的心肌细胞，48 h换液。