SNP检测方法
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❖ 一般来说，一个 SNP 位点只有两种等位基因，因此 又叫双等位基因。SNP在人基因组中的发生频率比较 高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点。
3
SNP分类
➢ 根据在基因中的位置，SNP 可分为基因编码区SNP(coding SNP, cSNP)、基因内含子区SNP和基因调控区SNP(regulatory SNP, rSNP)。
18
单碱基延伸法（single base extension)
19
基本步骤
1.设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA。 2.对PCR产物进行纯化（去除引物和dNTP)。 3.引物延伸。 4.延伸产物检测（放射性同位素标记法、发光
检测法、凝胶为基础的荧光检测法、质谱分 析法、变性高压液相色谱法等）。
9
核酸肽探针 （Peptide nucleic acids，PNA)
❖ 其骨架是肽键 ❖ 特点： 1、与靶分子高特异性地结合
（3个方面的影响）； 2、链挤入 （形成三链复合结
构）（表达调控以及反义治 疗方面）； 3、对核酸酶和蛋白酶均不敏 感（体外应用）。
10
与靶分子高特异性地结合
❖ Tm值高 ❖ 受盐浓度影响小（低盐浓度的体系） ❖ △Tm更大（一个PNA碱基的错配会使其Tm值降
❖ 分为： (1）利用△Tm； (2）杂交+荧光探针。
8
(1)利用△Tm
❖ 固定温度 等位基因特异核苷酸探针 (Allele-specific oligonucleotide ，ASO) 。 修饰过的探针：引入一个错配的碱基、 PNA、 LNAs 等
❖ 动态的加热过程 动态等位基因特异杂交 (dynamic allelespecific hybridization, DASH)
低8-20度） 所以，PNA/DNA的非特异结合能得到很好的排 除。
11
LNA(locked nucleic acids)
❖ 其结构是在RNA分子的2′羟 基和核糖环的4′碳原子间 连入一个亚甲基的“桥”。
❖ 特点： 1.能以很高的亲和性和互补
的DNA、RNA 或LNA 结合 （构象更利于杂交的稳定） 2.匹配和不匹配之间的△Tm 增加
单核苷酸多态性 （SNP）
林壹明 2011/5/9
1
主要内容
❖ 一、SNP概念、分类与特点 ❖ 二、SNP检测技术 ❖ 三、SNP研究现状 ❖ 四、SNP应用前景
2
SNP概念
❖ SNP(single nucleotide polymophism) 即单核苷酸 多态性，是指群体中变异频率大于1 %的单个核苷酸 改变而导致的核酸序列多态性，包括转换、颠换、缺 失和插入。但是比较常见的是转换和颠换，大约占 80%。
12
DASH
(dynamic allele-specific hybridization）
13
（2）杂交+荧光探针
分子信标（双分子间杂交）
14
分子信标（Molecular beacons）
分子信标是一种 新型的发夹结构 的寡核苷酸探针
是在样品PCR 过程中因和样品 DNA 杂交后而使 自身荧光构象改 变从而实现SNP 的检测。
因此针对不同等位基因设计平行引物,上游引物的3′端和多态性位点互补, 这样只有和引物完全互补的序列才能得到扩增,不同的等位基因依赖于所使 用的不同引物分别得以扩增。产生的PCR 产物可以通过凝胶电泳或实时 17 的荧光测定来实现对其的分析。
Taqman 法
优点：闭管进行， 减少污染。
缺点：淬灭难以彻底， 本底较高。
2.四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入 反应体系，如与模板配对，与引物的末端形成共价键， dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。
码区的数目。 ❖ （四）、具有代表性。 ❖ （五）、分析易自动化。由于每个SNP 位点通常仅
含两个等位基因——双等位基因(biallele)，在检 测时能通过一个简单的“+/−”分析进行基因型分 型，而无需分析片段的长度，因而易于自动化。
5
SNP检测技术
理想的检测SNPs的方法
——发ห้องสมุดไป่ตู้未知的SNPs，或检测已知的SNPs
15
2.基于酶的方法
1）DNA聚合酶 2）连接酶 3）限制性内切酶 4）外切酶FEN 5）RNase H
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DNA聚合酶法
❖ Taqman法 ❖ 单碱基延伸法 ❖ 焦磷酸测序法
此类方法是根据PCR 过程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现对SNP位点的检测, 是基于以下两点: (1) 错配出现在引物中部时致使稳定性降低,在严格杂交条件下将不能退火; (2) 错配出现在引物3′端时,引物将不能延伸。
20
焦磷酸测序法 (Pyrosequencing )
❖ 原理：DNA 聚合酶在一种dNTP的存在下进行 引物延伸反应,而引物的成功延伸将伴随焦 磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶的存在下能 引一种化学发光反应,通过发光计的实时监 测来达到检测的目的。
21
基本步骤
1.测序引物和DNA模板杂交（PCR扩增的、单链的），与 酶和底物孵育。
1.基于杂交的方法 2.基于酶的方法 3.电泳法 4.直接测序法
另外还包括化学法（如高锰酸钾法），物理法（例 如基质辅助的激光吸附／离子化飞行时间质谱分析） 等。
7
1.基于杂交的方法
❖ 原理: 短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行杂交时， 在完全匹配和有错配两种情况下，根据杂交复合体 稳定性的不同而将SNPs 位点检测出来。（Tm差异越 大，检测的特异性就越好）
➢ 其中cSNP根据是否改变编码的氨基酸又可分为同义cSNP (synonymous cSNP)和非同义cSNP (non-synonymous cSNP)。
4
SNP的主要特征
❖ （一）、密度高。SNPs 在人类基因组中的总数超过 300万。
❖ （二）、遗传稳定性好。 ❖ （三）、分布不均匀。非编码区的数目远远大于编
❖ 必须具备以下优点: (1) 适合自动化操作,简便、迅速; (2) 分析费用低,特殊试剂用量少; (3) 反应要严紧,即使不纯的样品也可得到可靠的结果; (4) 数据分析简单,易于自动化分析; (5) 反应的通量要大而灵活,一天可以完成几百，甚至到上百万个样品的
检测与分析。
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现在常用的SNP检测技术：
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SNP分类
➢ 根据在基因中的位置，SNP 可分为基因编码区SNP(coding SNP, cSNP)、基因内含子区SNP和基因调控区SNP(regulatory SNP, rSNP)。
18
单碱基延伸法（single base extension)
19
基本步骤
1.设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA。 2.对PCR产物进行纯化（去除引物和dNTP)。 3.引物延伸。 4.延伸产物检测（放射性同位素标记法、发光
检测法、凝胶为基础的荧光检测法、质谱分 析法、变性高压液相色谱法等）。
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核酸肽探针 （Peptide nucleic acids，PNA)
❖ 其骨架是肽键 ❖ 特点： 1、与靶分子高特异性地结合
（3个方面的影响）； 2、链挤入 （形成三链复合结
构）（表达调控以及反义治 疗方面）； 3、对核酸酶和蛋白酶均不敏 感（体外应用）。
10
与靶分子高特异性地结合
❖ Tm值高 ❖ 受盐浓度影响小（低盐浓度的体系） ❖ △Tm更大（一个PNA碱基的错配会使其Tm值降
❖ 分为： (1）利用△Tm； (2）杂交+荧光探针。
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(1)利用△Tm
❖ 固定温度 等位基因特异核苷酸探针 (Allele-specific oligonucleotide ，ASO) 。 修饰过的探针：引入一个错配的碱基、 PNA、 LNAs 等
❖ 动态的加热过程 动态等位基因特异杂交 (dynamic allelespecific hybridization, DASH)
低8-20度） 所以，PNA/DNA的非特异结合能得到很好的排 除。
11
LNA(locked nucleic acids)
❖ 其结构是在RNA分子的2′羟 基和核糖环的4′碳原子间 连入一个亚甲基的“桥”。
❖ 特点： 1.能以很高的亲和性和互补
的DNA、RNA 或LNA 结合 （构象更利于杂交的稳定） 2.匹配和不匹配之间的△Tm 增加
单核苷酸多态性 （SNP）
林壹明 2011/5/9
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主要内容
❖ 一、SNP概念、分类与特点 ❖ 二、SNP检测技术 ❖ 三、SNP研究现状 ❖ 四、SNP应用前景
2
SNP概念
❖ SNP(single nucleotide polymophism) 即单核苷酸 多态性，是指群体中变异频率大于1 %的单个核苷酸 改变而导致的核酸序列多态性，包括转换、颠换、缺 失和插入。但是比较常见的是转换和颠换，大约占 80%。
12
DASH
(dynamic allele-specific hybridization）
13
（2）杂交+荧光探针
分子信标（双分子间杂交）
14
分子信标（Molecular beacons）
分子信标是一种 新型的发夹结构 的寡核苷酸探针
是在样品PCR 过程中因和样品 DNA 杂交后而使 自身荧光构象改 变从而实现SNP 的检测。
因此针对不同等位基因设计平行引物,上游引物的3′端和多态性位点互补, 这样只有和引物完全互补的序列才能得到扩增,不同的等位基因依赖于所使 用的不同引物分别得以扩增。产生的PCR 产物可以通过凝胶电泳或实时 17 的荧光测定来实现对其的分析。
Taqman 法
优点：闭管进行， 减少污染。
缺点：淬灭难以彻底， 本底较高。
2.四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入 反应体系，如与模板配对，与引物的末端形成共价键， dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。
码区的数目。 ❖ （四）、具有代表性。 ❖ （五）、分析易自动化。由于每个SNP 位点通常仅
含两个等位基因——双等位基因(biallele)，在检 测时能通过一个简单的“+/−”分析进行基因型分 型，而无需分析片段的长度，因而易于自动化。
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SNP检测技术
理想的检测SNPs的方法
——发ห้องสมุดไป่ตู้未知的SNPs，或检测已知的SNPs
15
2.基于酶的方法
1）DNA聚合酶 2）连接酶 3）限制性内切酶 4）外切酶FEN 5）RNase H
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DNA聚合酶法
❖ Taqman法 ❖ 单碱基延伸法 ❖ 焦磷酸测序法
此类方法是根据PCR 过程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现对SNP位点的检测, 是基于以下两点: (1) 错配出现在引物中部时致使稳定性降低,在严格杂交条件下将不能退火; (2) 错配出现在引物3′端时,引物将不能延伸。
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焦磷酸测序法 (Pyrosequencing )
❖ 原理：DNA 聚合酶在一种dNTP的存在下进行 引物延伸反应,而引物的成功延伸将伴随焦 磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶的存在下能 引一种化学发光反应,通过发光计的实时监 测来达到检测的目的。
21
基本步骤
1.测序引物和DNA模板杂交（PCR扩增的、单链的），与 酶和底物孵育。
1.基于杂交的方法 2.基于酶的方法 3.电泳法 4.直接测序法
另外还包括化学法（如高锰酸钾法），物理法（例 如基质辅助的激光吸附／离子化飞行时间质谱分析） 等。
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1.基于杂交的方法
❖ 原理: 短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行杂交时， 在完全匹配和有错配两种情况下，根据杂交复合体 稳定性的不同而将SNPs 位点检测出来。（Tm差异越 大，检测的特异性就越好）
➢ 其中cSNP根据是否改变编码的氨基酸又可分为同义cSNP (synonymous cSNP)和非同义cSNP (non-synonymous cSNP)。
4
SNP的主要特征
❖ （一）、密度高。SNPs 在人类基因组中的总数超过 300万。
❖ （二）、遗传稳定性好。 ❖ （三）、分布不均匀。非编码区的数目远远大于编
❖ 必须具备以下优点: (1) 适合自动化操作,简便、迅速; (2) 分析费用低,特殊试剂用量少; (3) 反应要严紧,即使不纯的样品也可得到可靠的结果; (4) 数据分析简单,易于自动化分析; (5) 反应的通量要大而灵活,一天可以完成几百，甚至到上百万个样品的
检测与分析。
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现在常用的SNP检测技术：