限制性内切酶

简析限制性内切酶

限制性内切酶（即限制酶）是基因工程中的必用操作工具之一。基因工程是近年来高考中的热点，而对于限制酶的考查也是历年高考题中的常考知识点。

1限制酶的作用及影响因素

1.1 作用：切割特定的核苷酸序列

[高考赏析]（2008，全国i）已知某种限制性内切酶在一线性dna分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性dna分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的dna片段。现在多个上述线性dna分子，若在每个dna分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性dna分子最多能产生长度不同的dna片段种类数是（）

a.3

b.4

c.9

d. 12

【答案】c

【解析】：每一种限制性内切酶切割dna后会留下特征性的粘性末端，同时一次切割后，会把dna分割成两个片段，且不同的内切酶切后的片段不一样。若在3个酶切点切断，得到4种长度不同的dna片段；若在2个酶切点切断，得到3种长度不同的dna片段；若在1个酶切点切断，得到2种长度不同的dna片段。因此最多能产生4+3+2=9种长度不同的dna分子。

1.2 作用结果：形成dna片段末端

黏性末端：错位切，切下后的两端形成一种回文式的单链末端。

平末端：平切，在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无黏性末端的平口。

[高考赏析]（2008，江苏）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。

请根据以下图表回答下列问题。

（1）在采用常规pcr方法扩增目的基因的过程中，使用的dna 聚合酶不同于一般生物体内的dna聚合酶，其最主要的特点是。

（2）pcr过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？

__________。

（3）图1步骤③所用的dna连接酶对所连接的dna两端碱基序列是否有专一性要求？。

（4）为将外源基因转入马铃薯，图1步骤⑥转基因所用的细菌b通常为。

（5）对符合设计要求的重组质粒t进行酶切，。假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。

①采用ecorⅰ和pstⅰ酶切，得到_________种dna片断。

②采用ecorⅰ和smaⅰ酶切，得到_________种dna片断。

【答案】（1）耐高温（2）引物对b （3）否（4）农杆菌（5）

①2 ②1

【解析】：由图1—①过程知，用ecori酶和alui酶切割抗原基因dna片段会得到xy片段，由图1—②过程可知，用ecori酶和smai酶切割质粒产生mn片段。这样形成的两个dna片段用dna连接酶形成重组质粒。其中x、m连接处是ecori酶切割位点，m、n 之间还有一个psti酶切割位点。如果用ecori酶和psti酶切割重组质粒，将会在两个切割位点切割产生2种dna片段。但若用ecori 酶切割重组质粒，由于只有一个切割位点，所以只产生一个dna片段。

[高考赏析]（2005、天津理综ii 31）限制性内切酶ⅰ的识别序列和切点是—g↓gatcc—，限制性内切酶ⅱ的识别序列和切点是—↓gatc—。在质粒上有酶ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶ⅱ的切点。

①请画出质粒被限制酶ⅰ切割后所形成的黏性末端。

②请画出目的基因两侧被限制酶ⅱ切割后所形成的黏性末端。

③在dna连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？

【答案】：

①

②

③、可以连接。因为由两种限制性内切酶切割后形成的黏性末端是相同的。

【解析】：基因工程中往往用相同的限制性内切酶切割目的基因和运载体，但不同的限制性内切酶所切割出的黏性末端是相同的，也是可以互补配对的。因此，基因工程中有时也采用不同的限制性内切酶切割目的基因和运载体。

1.3 作用实质：使特定部位的两核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

1.4 影响因素：限制酶是一类酶，因此其活性受温度、ph等因素的影响。

[高考赏析]（2007、全国ii）下列有关基因工程中限制性内切酶的描述，错误的是（）

a、一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列

b、限制性内切酶的活性受温度影响

c、限制性内切酶能识别和切割rna

d、限制性内切酶可以从原核生物中提取

【答案】：c。

【解析】：由以上分析可知限制性内切酶能识别和切割dna。

2 限制性内切酶的特异性

限制性内切酶的特异性是指一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且在特定的切点上切割。一种酶识别切割部位一般具有反向重复序列，即在切割部位一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。

3 限制性内切酶与其它酶的比较

酶的种类作用

限制性内切酶（限制酶）将dna分子的脱氧核苷酸链的磷酸二酯键切开

dna聚合酶按模板有要求将单个脱氧核苷酸连接形成dna的子链，在dna复制时起作用

dna连接酶两个dna片段之间形成磷酸二酯键，缝合断口

解旋酶催化dna分子水解产生脱氧核苷酸，将dna分子中的碱基对打开。在dna复制和转录时起作用

rna聚合酶催化dna转录形成rna