乳酸菌的分离纯化

结果与分析 2.1 pH对菌体细胞吸附Lactocin-J23的影响 菌体细胞吸附法是基于细菌素在不同的pH条 件下，细菌素和产生菌菌体细胞之间存在不 同程度的吸附和解吸附现象。因此在利用菌 体细胞吸附法纯化Lactocin-J23之前，利用 Lactocin-J23 琼脂扩散法以抑菌圈为活性指标，考察了不 同pH范围条件下产生菌Lactic和革兰氏阳性 指示菌（枯草芽孢杆菌）菌体细胞吸附 Lactocin-J23的影响，结果见图2。
从表1可知，菌株J23菌体细胞吸附-解吸附过程细菌素 1 J23 Lactocin-J23相对于粗发酵液纯化了23.52倍，比活力由 55.65AU/mg提高到1309.09AU/mg，回收率为22.5%。与 (NH4)2SO4盐析法相比，具有菌体细胞吸附法具有步骤少、 操作简易、成本低、回收率较高等优点，可取代盐析法。
和洗脱缓冲液的pH进行了优化，以其最大程度的纯化 和回收Lactocin-J23。将细胞吸附法得到的LactocinJ23冻干粗样品溶于不同pH（3.5,6.5,8.0）的磷酸盐 缓冲液，上样吸附完毕后用含1M NaCl相同pH的缓 冲液洗脱，结果如表所示。
从表可知，不同的上样和洗脱pH对阳离子交换层析柱 SP-Sepharose FastFlow分离纯化Lactocin-J23结果具 有较大的影响。低pH（3.5）有利于Lactocin-J23在 SP-Sepharose Fast Flow层析柱上的吸附，但同样低 pH的洗脱缓冲液并不适于Lactocin-J23的洗脱。这可 能与Lactocin-J23在低pH条件下正电荷效应更强，更 容易吸附到阳离子交换柱介质上。碱性条件不适于 Lactocin-J23的上样和洗脱，这一方面可能是碱性pH 接近于Lactocin-J23的等电点，正净电荷效应减弱不 Lactocin-J23 利于Lactocin-J23的吸附；另一方面可能是LactocinJ23在碱性环境失活或者与基质之间发生的疏水反应 有关。综合纯化倍数和回收得率等指标，在后面的纯 化过程中选择上样和洗脱pH分别为3.5和6.5，纯化倍 数和回收得率分别达到36.8和20%。
乳酸菌细菌素由于其等电点在碱性范围而带有正电荷， 因此选用应用pH范围广的阳离子交换剂进行分离
实验步骤：1.用纯净水清洗AKTAprime蛋白质纯化系统 和层析柱直至基线平衡； 2.用10倍柱体积（10 CV）的50mmol/L磷酸钠缓冲液 (pH6.0)平衡阳离子交换层析柱（SP-sepharose Fast Flow）； 3.将提取的细菌素样品（或上清液）加入阳离子交换柱 收； 4.先用5倍柱体积（5 CV）0.2M NaCl溶液（50mmol/L 磷酸钠缓冲液配制）洗脱未结合杂蛋白，洗脱至基线 水平；
实验结果及分析
1.以(NH4)2SBiblioteka Baidu4盐析法沉淀菌株Lactocin-J23发酵 上清液中的细菌素，盐析曲线如图。
从图可知，随着(NH4)2SO4饱和度的提高，沉淀中 乳酸菌细菌素和可溶性蛋白质的量逐渐增加。在 (NH4)2SO4饱和度达到40%之前，沉淀中基本没有 表现出抗菌活性。随着(NH4)2SO4饱和度的增加， 沉淀中开始表现出抗菌活性，但一直增加到 (NH4)2SO4饱和度达到80%时，沉淀中的抗菌活性 虽然持续增加，但仍然没有抗菌活力达到最大值的 拐点出现，暗示发酵上清液中仍然有部分抗菌肽没 有完全沉淀。综合分析实验结果表明(NH4)2SO4盐 析法虽然是一种常见的蛋白质分离操作单元，但在 分离菌株Lactocin-J23产生的细菌素时候存在杂蛋白 多，目标产物得率低等缺点，再加上菌株Lactocin J23分泌合成目标抗菌肽的量较少，综合上述原因确 定(NH4)2SO4盐析法不适合于抗菌肽Lactocin-J23的 分离纯化。
图2菌株J23 与指示菌对细菌素Lactocin－J23的吸附率
从图2中可知，不同pH对J23菌体和指示菌细胞吸附 Lactocin- J23的能力有很大的影响。对产生菌J23来说， 在pH6.0时吸附率最大，达到80%；当pH低于3.0或大 于8.0时吸附率基本为0。对革兰氏阳性指示菌（枯草 芽孢杆菌）来说，在pH为2-9之间均能吸附上目标细 菌素，在酸性条件下其吸附能力较碱性条件下强，最 大吸附率为55%，低于J23菌体的最高吸附率。因此 在后续实验中确定在pH 6.0时吸附Lactocin-J23,在pH 2.0时从细胞表面解吸附。 2.2产生菌J23细胞吸附纯化Lactocin-J23 将活化的菌株J23接种到1000ml MRS液体培养基中， 37℃培养24h，70℃水浴加热25min，待冷却后根据 上述研究结果调节发酵液pH至6.0，在室温缓慢搅拌 2h，调节pH至2.0，分离纯化目标细菌素Lactocin J23 ，结果如表所示。
结果与分析：根据Lactocin-J23具有强疏水特 性，利用疏水层析柱Phenyl-SepharoseTM Fast Flow对SP-Sepharose Fast Flow得到的 Lactocin-J23样品进一步分离纯化，结果见图 所示。 Lactocin-J23经过Phenyl-SepharoseTM疏水层 析柱得到了较好的分离纯化，出现了一个单独 的活力峰，纯化倍数和回收得率分别达到45.1 和16.4%。由于蛋白质溶液在220nm附近的光 吸收值与肽键含量成正比，从图中可知， Lactocin-J23在220nm的吸收峰比280nm处强， 进一步说明了Lactocin-J23的多肽特性。
蛋白质分子量测定标准曲线
图4-7 Bac-J23的Tricine-SDS-PAGE电泳图谱
将经过阳离子交换、疏水柱纯化的Lactocin-J23样品， 利用Tricine-SDS-PAGE电泳对其纯度和分子量进行初 步鉴定，结果如图4-7所示。Lactocin-J23样品在 Tricine-SDS-PAGE电泳上呈单一条带，样品的迁移率 为0.802，其分子量近似为6.56KD。电泳结果表明联 合细胞吸附法，阳离子交换，疏水层析三步纯化单元 可以很好的分离纯化抗菌肽Lactocin-J23。 Lactocin-J23作为一种代谢产物，在发酵体系中的量 特别少，因此在纯化过程中应避免选择类似凝胶过滤 等将目标产物稀释的纯化方法，应尽量采取将 Lactocin-J23逐步浓缩的纯化策略。本研究采用的三 步纯化体系正是基于这一思路设计的，每步都大大浓 缩了Lactocin-J23，达到了较好的纯化效果。
乳酸菌细菌素结构的C末端含有一个或多个疏水中 心，因此选用疏水层析进行进一步分离
实验步骤：1.层析介质处理：Phenyl-SepharoseTM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，按照说明 书将疏水层析柱接入到AKTAprime蛋白质纯化系统； 2.柱平衡：用10mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.4)平衡2个 柱体积，始终保持层析介质处于溶液中。 3.上样：取样品加入平衡好的层析柱，并收集层析柱 下口流出组分，流速为1ml/min，每管收集3ml；
结果与分析：3.阳离子交换法分离纯化Lactocin-J23 目前报道的乳酸菌细菌素均为阳离子多肽，而且等 电点均偏碱性pH,根据这一性质本实验选择SPSepharose Fast Flow阳离子交换层析柱对利用细胞 吸附法得到粗Lactocin-J23进行进一步分离纯化，为 后续实验奠定基础。 3.1 pH对Lactocin-J23的纯化效果的影响 在利用离子交换树脂进行蛋白质分离时，pH是影响 纯化结果的最重要因素。在不同pH环境时，目标蛋 白质所带电荷不同，致使不同的pH环境中的蛋白质 在离子交换树脂上的吸附程度存在较大差异。 Lactocin-J23的正净电荷数目和抗菌活性均受所处环 境pH的影响，在利用阳离子交换层析柱SPSepharose Fast Flow分离纯化Lactocin-J23之前，对 上样样品的pH
图4-5 Phenyl-SepharoseTM纯化Bac-J23色谱图
Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定Lactocin AH纯 度与分子量
乳酸菌细菌素一般都是小分子量的活性蛋白肽。 常规的SDS-PAGE电泳系统分离小分子量多肽 效果差。本研究采取Tricine-SDS-PAGE电泳对 提取的乳酸菌细菌素的纯度和分子量进行测定
实验步骤：1.乳酸菌发酵液在70℃水浴加热25min后调 至吸附适宜pH，同时Bradford法和琼脂扩散法分别测定 发酵液蛋白含量和抗菌活力； 2.置于磁力搅拌器上室温搅拌30min，使细菌素充分吸 附在细胞上； 3.离心收集细胞，4℃于8000rpm/min离心30min，同时 测定离心上清液中蛋白含量和抗菌活力； 4.收集沉淀用与吸pH值相同的5mmol/L磷酸钠缓冲液洗 涤细胞1-2次； 离心30min收集沉淀悬浮于100mmo1/L NaC1溶液，用 5%磷酸调至最佳解吸pH； 6.4℃磁力搅拌12h， 4℃于10000r/min离心30min，收集 上清液0.22um无菌滤膜过滤,上清液即为细菌素提取物； 同时测定离心沉淀中蛋白含量和抗菌活力，以便计算抗 菌肽损失率。
步骤实验1.取乳酸菌发酵上清液，放置于磁力 搅拌器上，缓慢搅拌加入预先称量好的 (NH4)2SO4固体粉末至所需饱和度，操作必须 在10-15min内完成； 2.4℃放置过夜，使其充分沉淀，10000rpm离心 20min弃上清，用生理盐水溶解沉淀； 3.以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解装入2000Da透析 袋，4℃透析12h； 4.取透析袋内样品Bradford法测定蛋白含量。
5.Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定Lactocin-J23纯度 与分子量将低分子量蛋白标准品溶于含1%SDS、 5%β-巯基乙醇、50%甘油、0.0025%溴酚蓝的 缓冲液中，加热5min，与分离纯化得到的 Lactocin-J23样品一起在Tricine-SDS-PAGE电泳， 测定示踪染料前沿和蛋白质区带移动距离，计 算出标准蛋白样品区带相对于示踪染料的相对 泳动率Rm；以Rm对标准蛋白分子量的对数作 图得到一定分子量范围内的标准曲线，如图4-6 所示。标准曲线方程为y=0.0113x-0.0045， R2=0.9996表明本标准曲线的线性程度较高， 可作为Lactocin-J23分子量测定的标准曲线。
4.冲洗：用10mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.4)1-2 个柱体积洗去不吸附组分； 5.洗脱与收集：2mol/L(NH4)2SO4溶液按照 100%-0%2mol/L(NH4)2SO4梯度洗脱， 280nm处测定紫外吸收，收集洗脱液，分别检 测蛋白质含量和抗菌活性； （6）疏水介质清洗与保存：用0.5mol/LNaOH 洗脱，然后用水洗至中性放在20%乙醇中， 4℃保存备用。
乳酸菌素Lactocin-J23的分离纯化
分离纯化的方法
•制备乳酸菌素Lactocin-J23的发酵液 •(NH4)2SO4盐析法沉淀乳酸菌素 •菌体细胞吸附纯化乳酸菌素 •阳离子交换法分离纯化乳酸菌素 •疏水层析法分离纯化乳酸菌素 •乳酸菌素纯度的测定
(NH4)2SO4盐析法原理是根据蛋白质在水溶 液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水 形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电 荷的情况决定的。当(NH4)2SO4加入蛋白质 溶液，(NH4)2SO4对水分子的亲和力大于蛋 白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱 乃至消失。同时，(NH4)2SO4加入蛋白质溶 液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面 电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低， 使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
5.接着用1mol/L NaCl溶液洗脱结合目标蛋白， 速度为l ml/min，3ml/管分部收集， 280nm/220nm紫外检测收集蛋白峰，分别检 测蛋白质含量和抗菌活性；
6.用10倍柱体积（10 CV）50mmol/L磷酸钠缓冲液 (pH6.0)清洗层析柱，也可用2mol/L NaOH溶液对层 析柱进行再生处理，直至基线平衡； （7）收集所需组分，冷冻干燥保存，以便后续实验。