DNA指纹的遗传分析

DNA指纹的遗传分析

姓名：谢京合班级：生物技术校园卡号：320090922730

【实验原理】

“DNA指纹”是指可以利用DNA差异来进行与传统指纹分析相似的身份识别。DNA指纹是以DNA的多态性为基础，而卫星DNA的发现则是其最重要的奠基石。卫星DNA是由一短序列（即重复单位或核心序列）多次重复而成，因此也有人称其为可变数目串联重复序列（variable numbers of tandem reprat，VNTR）,在人类基因组中存在多种由不同重复单位组成的卫星DNA，重复单位的碱基序列在不同个体中具有高度的保守性，而卫星DNA的多态性则来源于重复单位的重复次数不同，并形成了众多的等位基因。例如，人类1号染色体上的VNTR D1S80，核心序列由16个核苷酸组成，拷贝数在14～41个之间，已知29种不同的等位基因。

1984年Jefferys等人首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人类核DNA的酶切片段杂交，产生了由10多条带组成的杂交图谱，不同个体杂交图谱上带的位臵就像指纹一样因人而异，因而Jefferys等人称之为DNA指纹图谱。产生DNA指纹图谱的过程叫做DNA指纹分析，目前包括PCR、RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）和RAPD（随机扩增多态性DNA）等方法。

DNA指纹图谱的基本特点：

（1）多位点性：基因组中某些位点的小卫星重复单位含有相同或相似的核心序列。在一定的杂交条件下，一个小卫星探针可以同时与十几个甚至几十个小卫星位点上的等位基因杂交。

（2）高变异性：DNA指纹图谱反应的是多个位点上的等位基因的特征，具有很高的变异性。发现两个无血缘关系个体具有相同DNA指纹图谱的概率仅为5×10-19，因此，除了同卵双胞胎，几乎不可能有两个人的DNA指纹图谱完全相同。

（3）稳定的遗传性：DNA指纹图谱中的谱带能够稳定遗传，杂合带遵守孟德尔遗传规律。子代DNA指纹图谱中产生与双亲都不同的新带的概率（基因突变）仅在0.001～0.004之间。DNA指纹图谱还具有体细胞稳定性，即用同一个体的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等的DNA作出的DNA指纹图谱是一致的。

由于DNA指纹图谱具有这些显著的特征，他已经成为最具吸引力的遗传标记。Jeffreys是第一个意识到DNA指纹可以建立个人身份识别系统的人，并且首先将其用于亲子鉴定，移民审查和凶杀侦破。1989年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。此外，它还被用于医生诊断及寻找与疾病连锁的遗传标记，探明动物种群的起源及进化过程，在作物的基因定位及育种上也有非常广泛的应用。

【实验材料】

人类口腔细胞。

【实验仪器与试剂】

1．仪器

微量移液器，小型离心机，恒温水浴锅，漩涡振荡器，PCR仪，电泳仪，电泳槽，透射式紫外分析仪（或凝胶成像仪）。

枪头，1.5mL，0.2 mL离心管，棉签，使用前均需121℃高温灭菌

2．试剂

NaCl，琼脂糖，溴化乙锭，Na2-EDTA，SDS，Tris，Proteinase K，冰醋酸，溴酚蓝，二甲苯腈蓝，蔗糖，甘油，DNA相对分子质量标记，Chelex 100树脂（Bio-Rad），PCR pre-mix(TaKaRa)。

3．溶液配制

（1）5% Chelex树脂

Chelex 100(Bio-Rad) 0.5g

50mmol/L Tris-HCl 10mL

用4mol/L NaOH调pH至11，室温可保存3个月，使用前充分混匀。

（2）2.0％琼脂糖凝胶：称2.0g琼脂糖放入250ml三角烧瓶，加入1×TAE溶液100mL微波炉加热溶解，冷却至60℃左右加入1μg/mL溴化乙锭（EB），缓慢混匀后倒胶板。

（3）溴化乙锭（EB）：用无菌水配制5mg/mL储藏液，工作浓度1μg/mL。

注意；溴化乙锭为诱变剂，有致癌作用。配制、稀释和染色时必须戴手套。（4）0.5mol/L EDTA(pH8.0)

Na2-EDTA 18.61g

NaOH 2g

蒸馏水定容至100mL，室温保存。

（5）10×TAE电泳缓冲液

Tris 48.4g

冰醋酸 11.42mL

0.5mol/L EDTA(pH8.0) 20mL

蒸馏水定容至1000mL，室温保存。

（6）10×上样缓冲液（Loading dye）

溴酚蓝 0.25g

二甲苯腈蓝 0.25g

蔗糖 50.00g（或甘油50mL）

用60mL无菌水（用甘油50mL时，49mL）溶解上述试剂，再定至100mL,室温保存即可。

（7）10%SDS：SDS 10g用无菌水溶解后（可加热），定容至100mL，室温保存。（8）蛋白酶K溶液

20mg/mL蛋白酶K水溶液 5mL

10%SDS 1mL

无菌水 94mL

冰箱冷藏。

（9）无菌水：蒸馏水或去离子水，高温灭菌。

（10）1mol/L Tris-HCl(pH8.0)：将12.1g Tris溶解在80mL蒸馏水中，加盐酸调节pH至8.0，加蒸馏水定容至100mL。

4．引物

Primer1：5’-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3’

Primer2：5’-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3’

【实验操作】

1．收集DNA样本

（1）先漱口，然后用灭菌的牙签充分擦刮口腔内壁，将该牙签放入1.5mL装有1mL无菌水的小离心管中，使粘附在牙签表面的口腔细胞悬浮其中（以能看到悬浮物为好）。震荡10s，10000 r/min离心1min。

（2）从离心管中吸出970μL无菌水，注意不要吸到沉淀。

（3）向离心管中加入200μL 5% Chelex 100，震荡10s混匀。

（4）加入2μL蛋白酶K，混匀，56℃保温5min。

（5）剧烈震荡10s,沸水浴8min。

（6）10000r/min离心3min，离心管中溶液分成上下两层：下层为Chelex100和细胞碎片的沉淀，上层溶液含DNA分子，可以直接用作PCR模板。

此DNA样本可在4℃或-20℃保存，必要时可在使用前再次加热并离心，使管内物质分层。

2．PCR扩增D1S80等位基因

（1）每个人用记号笔在0.2mL PCR管上做好标记。

（2）准备冰盒，开始反应前尽量使PCR管保持在冰上。

（3）依次加入下列成分，配制25μL体系的PCR反应溶液：

PCR pre-mix 12.5μL

引物1 1μL

引物2 1μL

口腔细胞DNA样本 10μL

加无菌水至总体积25uL。

（4）轻弹管壁，混匀溶液。

（5）离心10s，使管壁上的液滴落下。

（6）按下列程序开始PCR反应：

94℃，1 min

94℃，15s

68℃，15s

72℃，15 s

30个循环

72℃，10min

4℃暂时放臵，直至开始电泳

3．PCR扩增产物鉴定与D1S80等位基因分析

（1）准备冰盒。

（2）取出完成反应的PCR管，放冰上待用。

（3）取出10µL D1S80 PCR扩增产物放入0.5mL离心管。

（4）加入2µL上样缓冲液。

（5）轻弹管壁混匀，再瞬时离心，使管壁上的液滴下落。

（6）用1×TAE电泳缓冲液配制2.0%琼脂糖电泳凝胶。

（7）60V预电泳1～2min。

（8）在凝胶上选一孔加入6µL的DNA相对分子质量标记（DNA100bp Ladder）。（9）每人将刚刚准备好的10µL D1S80 PCR扩增产物+2 uL的上样缓冲液各自加